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羊抗豬IgG免疫血清抗體*,羊抗豬IgG免疫血清抗體用于免疫組化實驗,WB實驗,相應的標記抗體有HRP標記抗體,FITC標記,BIO等。
【貯存條件】: 貯存于-20℃. 本品應在低溫下保存,長時間在暴露在空氣中,含量會有所降低。
規格:0.5ml
材料和方法
. 材料 人成骨肉瘤MG63細胞為本實驗室保存。重組質粒MycSSHL(WT)、MycSSHL(S937A S978A/2SA)以及recombinant cofilinHis6由王巖教授惠贈。脂質體 2000( Invitrogen公司)。高糖DMEM培養基(美國Gibco 公司),胎牛血清(Hyclone公司),和EDTA(Sigma 公司)。A2387,KN93,CaM,重組Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain,Calbiochem)。抗體:Myc (9E0;Roche),HA (3F0;Roche),Pcofilin,Cofilin(Santa Cruz), CaMKⅡδδ4 (Trans Genic Inc.),PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒(邁晨科技有限公司)。
.2 蛋白印跡實驗 MG63細胞鋪于35 mmol/L培養皿中,待細胞密度達到60%~70%時,轉染MycSSHL,48 h后換無血清培養基培養3 h,分別加入濃度為0.5,,2.5,5 μmol/L的A2387孵育0 min后裂解細胞,離心取上清加入凝膠加樣緩沖液,沸水浴上加熱5 min,上樣、電泳、轉膜、雜交〔一抗分別為Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及CaMK Ⅱ δ(4)〕、ECL顯色。
.3 體外激酶測定 MycSSHL(WT)及其突變體MycSSHL(2 SA)分別轉染至MG63細胞,48 h后采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體,對照組為抗IgG抗體。回收MycSSHL,加入0.6 μg/ml重組活性CaMKⅡ(單獨或同時加入抑制劑KN93)以及00 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 于 20 μl 激酶反應緩沖液中,30℃反應40 min。反應產物進行SDSPAGE電泳、轉膜,應用放射自顯影技術檢測32P 標記的SSHL水平。
.4 體外SSHL磷酸酶活性測定實驗 MycSSHL(WT)或MycSSHL (2 SA)轉染至MG63細胞,48 h后,采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體,對照組為抗IgG抗體。回收MycSSHL,加入0.6 μg/ml CaMKⅡ(單獨或同時加入抑制劑KN93),20 μg/ml CaM,以及 6.3 μg/ml cofilinHis6 于 20 μl 反應緩沖液(50 mol/L HEPES,pH 7.4,0. mol/L CaCl2,0.5 mol/L EDTA,3 mol/L MgCl2,00 mmol/L NaCl, mol/L dithiothreitol,0.5 mg/ml BSA, μg/ml leupeptin),中30℃反應2 h。反應產物進行SDSPAGE電泳、轉膜、雜交(一抗分別為Pcofilin,Cofilin, cmyc 抗體)、ECL顯色。
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