兔臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔臍靜脈內(nèi)皮分離自臍帶組織；它是臍靜脈的重要結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞之一，在機體的正常生理過程中發(fā)揮著重要作用。臍帶是哺乳類的連接胎兒和胎盤的管狀結(jié)構(gòu)，臍帶中通過尿膜的血管即臍動脈和臍靜脈，卵黃囊的血管即臍腸系膜動脈及臍腸系膜靜脈。在子宮中，子宮動脈在胎盤的母體部分出的毛細(xì)血管，與胎盤的子體部胎兒毛細(xì)血管靠近，在此處母體和胎兒的血液間進行CO2和O2，代謝產(chǎn)物即代謝廢物和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。臍動脈將胎兒產(chǎn)生的廢物運送至胎盤，臍靜脈將O2和營養(yǎng)物質(zhì)從胎盤運送給胎兒。
方法簡介：

公司實驗室分離的兔臍靜脈內(nèi)皮采用yi蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法、并通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實驗室分離的兔臍靜脈內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

一、細(xì)胞培養(yǎng)

1取材 在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細(xì)胞（視實驗?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細(xì)胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。2培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

二、原代細(xì)胞分離

凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。1懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。2實體組織材料的分離方法對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。

三、細(xì)胞增殖檢測技術(shù)

目前主要有兩種用于檢測細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測定進行分裂

的細(xì)胞數(shù)來評價細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細(xì)胞活力（cell viability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評價細(xì)胞的增殖能力。顯然，細(xì)胞活力檢測法并不能最終證明檢測樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時若采用細(xì)胞活力檢測法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細(xì)胞數(shù)大于對照組的事實說明藥物可促進細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以最直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

取材：首先，用培養(yǎng)液濕潤所取的組織材料，并用鋒利的眼科剪去除附在其上的脂肪和結(jié)締組織。接著用平衡液（如PBS或Hanks液）漂洗，再用眼科彎剪將組織塊剪成小塊。多次用PBS或Hanks液漂洗，直到液體清亮、無油滴為止。

接種：用濕潤的吸管吸取切碎的組織塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶皿中，并按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上。注意不要過多，確保組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上。

培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側(cè)的對側(cè)面加足培養(yǎng)液，避免組織塊與培養(yǎng)液接觸，然后塞緊瓶塞。將種植了組織塊的一側(cè)朝上，靜置于37℃培養(yǎng)箱中。待組織塊貼壁1到3小時后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒在培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置。換液：每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時間。

一、原代細(xì)胞計數(shù)

將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

靜置3分鐘。

鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

二、原代細(xì)胞活力

將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。

加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力。

死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。