1. 石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？

一般來(lái)說(shuō)，如果用多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的片子做正常免疫組織化學(xué)染色的話(huà)是不會(huì)掉片子的。但如果要做抗原修復(fù)的話(huà)，如果片子處理不好的話(huà)是有可能掉片子的。可以試試一下的方法：

a.我們一般用APES：丙酮=1:50的處理液來(lái)處理片子，處理5min左右，然后水洗，烘干既可用于貼片。如果把水滴再處理好的片子上，水比較聚的話(huà)說(shuō)明片子處理的好。

b.貼片子的時(shí)候，展片的時(shí)間要把握好，不要太長(zhǎng)，否則不利于貼牢。

c.烤片子也很重要，切好的片子zui先不要馬上收起來(lái)，而是水平至于烘片臺(tái)上37度兩個(gè)小時(shí)以上，一是水分*烘干。然后做染色前zui再在60度烘箱烘1個(gè)小時(shí)。

d.再補(bǔ)充一點(diǎn) ，石蠟包埋時(shí)，酒精梯度脫水以及浸蠟等一點(diǎn)要充分，這對(duì)貼片也有影響。

2. DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？

著色不均勻可能與你的實(shí)驗(yàn)手法有很大關(guān)系，可能原因有：

a.切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

b.有可能是顯色液底物加到片子上后沒(méi)有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后zui將片子來(lái)回左右晃動(dòng)幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。

c.如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫(huà)的太小，顯色液覆蓋的面積不過(guò)大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。zui外側(cè)的組織片zui離顯色液外緣0.5cm。

3. 免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果？

免疫組化出現(xiàn)陰性結(jié)果有可能組織本身就沒(méi)有信號(hào)，也有可能是抗體出了問(wèn)題。你可以找一些陽(yáng)性組織做一下，以確定是抗體的問(wèn)題還是組織本身就沒(méi)有所檢測(cè)的抗原表達(dá)。還有，你可以提高抗體的濃度，或者試一試抗原修復(fù)等方法，也許會(huì)得到意想不到的結(jié)果。

4. 切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？

a.也許是抗體本身有問(wèn)題，因?yàn)橛泻芏喙镜目贵w質(zhì)量并不好，很容易上背景，可以換一種抗體 試試。

b.如果經(jīng)費(fèi)不允許換抗體的話(huà)，你可降低抗體的濃度，并隨時(shí)注意觀(guān)察顯色，在能看到信號(hào)的情況下盡量降低背景。

c.可以換一種封閉液，不同的封閉液對(duì)某種來(lái)源的抗體來(lái)說(shuō)，會(huì)有不同的封閉效果。

d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所檢測(cè)動(dòng)物組織的正常血清，這樣可以去除一部分非特異性染色。

5. 有人在一抗孵育前用tritonX100來(lái)通透細(xì)胞，對(duì)石蠟切片需要否？
用石蠟切片做免疫組化是不需要透膜處理的，一是因?yàn)槭炃衅容^薄，另外一個(gè)原因是在包埋過(guò)程中細(xì)胞膜已經(jīng)被破壞，所以這一步可以省略。

6. 蘇木素復(fù)染的時(shí)間應(yīng)該是多少？復(fù)染過(guò)度咋辦？

復(fù)染時(shí)間不需要太長(zhǎng)，當(dāng)然這也要根據(jù)蘇木精的質(zhì)量來(lái)確定，但基本上不要超多一分鐘。染色過(guò)深的話(huà)可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量濃鹽酸）分色，分色的另外一個(gè)目的是洗掉蘇木精在細(xì)胞質(zhì)中的非特異性結(jié)合，這樣可以使細(xì)胞質(zhì)中的特異信號(hào)更明顯。所以不管復(fù)染是不是過(guò)度，分色這一步zui不要省掉。分色后記得再用氨水返藍(lán)一下。

7. 抗原修復(fù)應(yīng)在滅活POD之前還是之后？

熱修復(fù)后不需要滅活POD