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技術(shù)文章
磷酸鈣-DNA共沉淀法
點(diǎn)擊次數(shù)：452 發(fā)布時(shí)間：2012-12-5
磷酸鈣-DNA共沉淀法
核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA僅有1%～5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。
一、配液
1. 2×HBS：1.63g NaCl；1.19g Hepes；0.023g Na2PO 4-2H 2O；加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存
2. 2mmol/L CaCl 2 過濾除菌
3. TE：0.1mmol/L EDTA、1mmol/L Tris-HCL，PH8.0
4. G418（*G418）液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H 2O至10mL過濾除菌4℃保存。
5. G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L
注意：對受體細(xì)胞先做預(yù)試驗(yàn)，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死細(xì)胞50%以上的zui低濃度。
二、操作步驟[方法一]：
1.供體DNA制備：方法按DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。
2. 受體細(xì)胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動(dòng)物細(xì)胞系作為受體細(xì)胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細(xì)胞系等，該細(xì)胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，接種密度為2×10 4 /cm 2 ，用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO 2 培養(yǎng)，待細(xì)胞占50～70%瓶底面積時(shí)，用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。
3. DNA-磷酸鈣沉淀物的制備
① 將供體細(xì)胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時(shí)向供體細(xì)胞DNA液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液（20mg/L）220μl和2×HBS 250μl（PSV2-neo為1～2mg/L的使用量）。
② 取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl 2 混勻30秒。
③ 然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。
4. 轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞
①將處于對數(shù)生長期已占瓶底50～70%的受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。
②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中搖勻。
③置37℃ 5% CO 2 培養(yǎng)24h或更長，使細(xì)胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。
④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。
⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。同時(shí)設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞。
⑥培養(yǎng)大約3～5天，對照細(xì)胞大部分死亡，這時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。
⑦2周后對照細(xì)胞死亡，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瓶中可見有抗藥性的細(xì)胞克隆出現(xiàn)，待其增大后再進(jìn)行化和擴(kuò)大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，并做進(jìn)一步鑒定。
本實(shí)驗(yàn)要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，這樣可使受體細(xì)胞獲得*（neo）基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”，也可測出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標(biāo)記。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細(xì)胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞建立細(xì)胞株。若以獲取“轉(zhuǎn)化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細(xì)胞中提取的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞即可，其方法如下：
三、DNA轉(zhuǎn)染[方法二]：
1. 配制磷酸轉(zhuǎn)染液：NaCl 8.0g；Hepes 5.0g 用時(shí)現(xiàn)配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65；Na 2HPO 4 0.099g 消毒滅菌，-20℃貯存?zhèn)溆茫患訙厮?1000mL
2. 按前面介紹的方法提取癌細(xì)胞DNA。
3. 取供體DNA50～100μg，加3M NaCl或醋酸鈉，使zui終濃度至0.3M混勻。
4. 再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。
5. 加入轉(zhuǎn)染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl 2 ，含zui終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次（不用攪拌器以防DNA袢結(jié)），置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現(xiàn)微濁蘭色時(shí)，即可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
6. 取生長狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對數(shù)生長期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)，更換培養(yǎng)液（5ml/瓶）1次。
7. 轉(zhuǎn)染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小時(shí)。
8. 培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15%甘油處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時(shí)血清用量降至5%，培養(yǎng)2～3周。
9. 檢測：逐日觀察，待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后，分離，擴(kuò)大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。