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細胞培養常見問題分析

細胞培養
1、冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后， 須立即放入37 ℃水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。
2、細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
3、可否使用與原先培養條件不同之培養基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。
4、可否使用與原先培養條件不同之血清種類？
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源， 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
5、何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。
6、培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。
7、何時須更換培養基？
視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。
8、培養基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態下， 培養基中不應添加任何抗生素。
9、附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。
10、懸浮性細胞應如何繼代處理？
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。
11、欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。
12、細胞之接種密度為何？
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
13、細胞冷凍培養基之成份為何？
動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即為無菌狀況， *次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
15、冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
15、細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
16、應如何避免細胞污染？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法。
17、如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？
加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。
18、支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。
19、支原體污染會對細胞培養有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。
20、CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？
定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
21、為何培養基保存于4 ℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？
培養基保存于4 ℃ 冰箱中， 培養基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。
22、各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
23、購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？ 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久。
24、收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用*小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊 。
25、如何選用特殊細胞系培養基？
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養AIM V（12005）培養基（SFM）。
26、L-*在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
L-*在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-*可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-*在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終定論。L-*的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
27、GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？
GlutaMAX-I 二肽是一個L-*的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-*來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-*供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-*幾乎*降解。
28、什么培養基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。
29、培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
30、二價離子抑制*活性嗎？使用*時加入EDTA的目的是什么？
二價離子的確抑制*活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制*的活性。建議*處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。
31、書上說，Hank‘s *（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank’s *（HBS）和Earle‘s*（EBS）有什么本質的功能差別？
HBS和 EBS 的主要差別在于*的水平,在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。*需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。
血清
1、保存血清的方法?
建議血清應保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。
2、如何解凍血清才不會使產品質量受損?
建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規則地搖晃均勻。
3、血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理?
血清中沉淀物的出現有許多種原因，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。
4、為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。
5、有必要做熱滅活嗎?
實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
6、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?
GIBICO的胎牛血清 沒有預老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。
7、如何避免血清里沉淀物的產生?
解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法（-20℃至4℃至室溫），若血清解凍時改變的溫度太大（如-20℃至37℃），實驗顯示非常容易產生沉淀物。
解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。
血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。