(二)材料
1. 生長成片的MDCK細胞
2. 無菌的T25細胞培養瓶
3. D-MEM培養液(含有L-)
4. 青、母液(10000 U/mLG;10000µg/mL硫酸),分裝后保存于-20℃
5. HEPES緩沖液,1M母液
6. 胎牛血清
7. EDTA-(0.05%,0.53mM EDTA-4Na),分裝后保存于-20℃
8. 7.5%牛血清白蛋白組分V
9. 1mL、10mL無菌移液管
10. 70%~75%的酒精
注意事項:經常檢查試劑使用的有效期。
(三)實驗步驟
這里以T75細胞瓶的單層細胞培養為例,敘述MDCK細胞的培養程序。如果細胞瓶的規格有變,MDCK細胞懸液的量必須做相應的調整。
1. D-MEM培養液的準備
500mL D-MEM液中加入:
青、母液5mL(終濃度達:100U/mL;100µg/mL),
HEPES緩沖液12.5mL(終濃度:25mM)。
7.5%牛血清白蛋白組分Ⅴ 12.5mL
2. 細胞生長液的準備
胎牛血清10mL加到90mL的上述(1)的液體中,使胎牛血清的終濃度為10%。
3. 首先將細胞培養瓶中的培養液棄去,加入5mL在37℃水浴中預熱的EDTA-。
4. 溫和地搖動細胞瓶1min,使EDTA-均勻分布在整個細胞薄層。然后用移液管吸去EDTA。
5. 重新加入5mL在37℃水浴中預熱的EDTA-重復上述步驟。
6. 加入1mLEDTA-使其均勻分布在整個細胞薄層,37℃孵育細胞瓶直至細胞從塑料細胞瓶的表面分離(約5~10min)。必要時可以搖動或吹打來分離細胞。然后加入1mL胎牛血清滅活殘余的。
7. 加9mL已經配置好的含有L-的D-MEM培養液,輕輕用移動移液管來吹散細胞團。
8. 取10mL混合物加到90mL細胞生長液(細胞懸液的濃度大約為每毫升含105細胞)
9. 每個T25細胞培養瓶加入6mL(6×105/mL)細胞懸液,剩余的細胞懸液可以加到T75細胞瓶用于細胞傳代。通常6mL細胞懸液2~3日可生長成片(80%~90%)的單層細胞。
10. 于37℃,5%CO2培養箱里培養細胞,每天觀察細胞狀態,以供進一步實驗用。