士鋒生物蔗糖梯度分析

時(shí)間：2015-7-24閱讀：932

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蛋白在蔗糖梯度中的沉降率可以用于與已經(jīng)知道的S值與其在同梯度中蛋白相比來確定其S值。從而可用于計(jì)算蛋白的大約的分子量，也可用于鑒定兩個(gè)蛋白的相互作用，如果他們在相同梯度出峰。

一、材料和試劑

1. 蔗糖（SigmaCatalog No.S0389）

2. 明膠（SigmaCatalog No.G9136）

二、儀器

1.離心機(jī)（BeckmanFalcon，TLS-55）

2.梯度混合器（Sigma）

三、步驟

1. 用與蛋白樣品緩沖液相同的緩沖液制作10%和40%的蔗糖溶液。

2. 用的1%明膠包被管子，用1%的明膠溶液加滿管子，倒出凝膠溶液并用ddH₂O洗滌。

3. 制作10-40%蔗糖梯度

注意：梯度混合器有兩個(gè)室，儲存室和混合室，并用一個(gè)不互聯(lián)的膜隔開。用另一個(gè)膜來調(diào)控從混合器中流出。在混合室中的磁力攪拌器可以幫助保持一個(gè)不變的梯度所有的混合器都有一個(gè)平面用于放在磁力攪拌器上。

4. 將梯度混合器放在磁力攪拌器上面，使其水平。將一個(gè)小的攪拌子放入混合室中。

5. 使所有瓣膜關(guān)閉，用1/2想要的梯度量加入每個(gè)室中，用40%在混合室，10%蔗糖在儲存室。

6. 打開磁力攪拌器使得它輕輕的攪拌。

7. 將輸出管放到一個(gè)離心管中，使起剛剛碰到接近頂部的邊。

8. 同時(shí)打開兩個(gè)膜，40%蔗糖溶液開始進(jìn)入離心管，10%蔗糖開始與40%蔗糖混合。當(dāng)梯度接近離心管的頂部關(guān)閉兩個(gè)瓣膜。確定有足夠的地方放頂部的梯度樣品。

9. 把梯度的轉(zhuǎn)子放在冷室中2~48 hrs，確定管子平衡并且樣品在頂部，樣品只占很少的體積（如100 μl 對于2.2 ml 梯度溶液）。

10. 55 000 rpm 離心2.5小時(shí)。

11. 收集組分并且用Western blotting 檢測。醛縮酶（158 kD，7S）和甲狀腺球蛋白（690 kD，19S）（Bio-RadLaboratories）并用于marker被用于一起檢測。

四、配置方法

1. 10%蔗糖溶液：10 mg 蔗糖溶于100 ml ddH₂O

2. 40%蔗糖溶液：40 mg 蔗糖溶于100 ml ddH₂O

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