【實驗目的】

1．學習親和層析的原理。

2．掌握親和層析法分離蛋白質的技術與操作。

【實驗原理】

親和層析是以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質，這樣的方法稱為金屬螯合親和層析。蛋白質對金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據。已知蛋白質中的和半殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩定的絡合物，因此，連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質。過渡金屬元素鎳在較低pH范圍時（pH 6-8），有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質，在堿性pH時，使吸附更有效，但選擇性降低。金屬螯合親和層析行為在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。

本實驗室純化的目的蛋白是用IPTG誘導表達的pGFPuv，該蛋白是和6His融和表達的，含有特定的標記物，這種可溶性蛋白質能用金屬親和層析法進行分離，且操作簡單，快速，純化效率高。

【試劑與器材】

<一>試劑

1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL

2. 2mol/L NaCL 溶液 50mL

3. 1mol/L NaOH溶液 50mL

4. 0.2mol/L NiSO4溶液 50mL

5. 平衡緩沖液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL

6. Ni2＋ Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL

7. 重組pGFPuv質粒大腸桿菌工程菌經誘導表達的細胞裂解蛋白樣品 20—50ml

8. 洗滌液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0

9. 洗脫液：300mmol/L咪唑， 50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0

10 20%乙醇溶液50ml

<二>器材

1. 1.5cm X 50cm層析柱

2. 蠕動泵

3. 紫外檢測儀

4. 自動收集器

5. 伍豪色譜工作站

【操作方法】

1. 樣品的制備

細胞的培養及熒光蛋白表達看實驗十，細胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用細胞培養液，8000r/min，離心5min，去上清液，菌體用平衡緩沖液洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一（細胞培養液）體積的平衡緩沖液充分懸浮，冰浴下進行高壓破菌處理。然后8000r/min。離心30min，取上清液。放冰箱備用。

2. 親和層析柱的安裝

把層析柱固定在鐵支架上，上端的柱頭擰下，柱下端出口用夾子封閉。加入少量的無離子水，排去下端的空氣泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝膠5－10mL到燒杯中，加入少量的無離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進柱內，打開下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。親和層析劑為5—10mL。然后，將上端的柱頭擰緊，并將頂端和下端用軟管連接封閉備用。

3. 層析系統的安裝、調試

（1）蠕動泵的調試：打開背后電源開關，按下start按鈕，上下箭頭調節流速為15rpm（約2ml/min），將軟管充滿去離子水。

（2）系統的連接：將蠕動泵的出水管與層析柱上端管相連，層析柱的下端管與紫外檢測儀的進樣端連接，將紫外檢測儀的out端與自動收集器相連。

（3）紫外收集器的調試：打開紫外背后開關，調節靈敏度旋鈕（ABS－Range），調節調零旋鈕。

（4）自動收集器的設置：打開電源開關，按“復位"鍵，確定出液管的位置，按“手動"按鈕，進行設置，如選擇120seconds一管進行收集，按“自動"即開始計時收集。

（5）伍豪色譜工作站的使用方法：點擊桌面的“伍豪色譜工作站“圖標打開程序，點擊左上角的圖標，選擇A或B通道，點擊“▲"即開始采樣，采樣結束后點擊“■"即結束采樣，然后載入A或B通道譜圖，保存結果，并打印結果。

4. 層析柱的使用前處理：

（1）用5X柱床體積去離子水清洗乙醇封存的Ni 2＋-Chelating Sepharose Fast Flow親和層析柱，去除乙醇

（2）用2X柱床體積的0.2M NiSO4過柱，注意觀察現象

（3） 用10X柱床體積的去離子水清洗，用5X柱床體積平衡緩沖液平衡柱子

5. 上樣：

先從20 mL裂解上清液中取出50 μL用于電泳，作為親和層析分離前上清液中的總蛋白區帶對照圖譜。然后以每分鐘2mL的流速上層析柱，分部收集流出液，每管3 mL（記錄的紫外吸收峰為穿流峰，取zui高的一管樣品液用作電泳）。平衡緩沖液過層析柱，直到紫外吸收峰不再下降（達到平臺期為止）。

6. 洗滌：

用含50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液25 mL冼脫，分部收集洗脫液，每管5 mL，取紫外吸收zui高的一管用于電泳。

7. 洗脫：

用含300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液10 mL洗脫，自動收集洗脫液。每管收5 mL，當紫外吸收達zui高峰時取樣用于電泳及Western blotting實驗。

8. 層析柱的后處理及封存：

（1）用2X去離子水清洗柱子

（2）用10X0.5M NaCl，50mM EDTA (pH 8.0) 洗去結合的鎳離子

（3）用10X去離子水清洗柱子

（4）用10X1M NaOH洗柱，去殘留蛋白

（5）用大約10X去離子水清洗柱，去除NaOH，直到pH值低于9

（6）用大約2X柱床體積乙醇過柱，拆除柱子，保存柱料于20％乙醇中

9. 12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測：

分別取50μL穿流峰流出液、50mmol/L咪唑緩沖液洗滌的流出液和300mmol/L咪唑緩沖液洗脫的流出液。外加一個上柱前的樣品液和蛋白Marker作比較。進行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和層析分離純化的結果。

【注意事項與提示】

1. 不管是裝柱還是上樣、洗脫，在整個操作過程中，水或溶液面都不能低于凝膠柱平面。否則，凝膠柱會產生氣泡，就會影響層析效果。

2. 樣品上柱和洗脫過程，其流速都要慢，分離效果才好。

3. 親和層析劑可回收，經再生可循環使用。該親和層析劑用20%乙醇浸泡于冰箱保存。

4. 親和層析柱在再生處理、上樣、洗脫過程中其顏色都有明顯變化（白、藍、綠），只要細心操作，樣品是否被吸附上去或被洗脫下來？都能觀察到從而作出判斷。