一、原理
(amylase)包括幾種催化特點不同的成員,其中α-隨機地作用于淀粉的非還原端,生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖,同時使淀粉漿的粘度下降,因此又稱為液化酶;β-每次從淀粉的非還端切下一分子麥芽糖,又被稱為糖化酶;葡萄糖則從淀粉的非還原端每次切下一個葡萄糖。產生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原,生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。活力的大小與產生的還原糖的量成正比。可以用麥芽糖制作標準曲線,用比色法測定淀粉生成的還原糖的量,以單位重量樣品在一定時間內生成的還原糖的量表示酶活力。幾乎所有植物中都存在有,特別是萌發后的禾谷類種子活性zui強,主要是α-和β-。Α-不耐酸,在pH3.6以下迅速鈍化;而β-不耐熱,在70℃15min則被鈍化。根據它們的這種特性,在測定時鈍化其中之一,就可測出另一個的活力。本實驗采用加熱鈍化β-測出α-的活力,再與非鈍化條件下測定的總活力(α+β)比較,求出β-的活力。
二、材料、儀器設備及試劑
(一)材料:萌發的小麥種子(芽長約1cm)。
(二)儀器設備:1. 分光光度計;2. 離心機;3. 恒溫水浴(37℃,70℃,100℃);4.具塞刻度試管;5. 刻度吸管;6. 容量瓶。
(三)試劑(均為分析純):1. 標準麥芽糖溶液(1mg/ml):稱取100mg麥芽糖,用蒸餾水溶解并定容至100ml;2. 3,5-二硝基水楊酸試劑:稱取1g3,5-二硝基水楊酸,溶于20ml2mol/L NaOH溶液中,加入50ml蒸餾水,再加入30g酒石酸鉀鈉,待溶解后用蒸餾水定容至100ml。蓋緊瓶塞,勿使CO2進入。若溶液混濁可過濾后使用;3.01mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液:A液(0.1mol/L 檸檬酸):稱取C6H8O7.H2O 21.01g,用蒸餾水溶解并定容至1L;B液(0.1mol/L 檸檬酸鈉):稱取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g,用蒸餾水溶解并定容至1L。取A液55ml與B液145ml混勻,即為0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液;4.1%淀粉溶液:稱取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。
三、實驗步驟
(一)麥芽糖標準曲線的制作:取7支干凈的具塞刻度試管,編號,按表(詳教材)加入試劑。搖勻,置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻,加蒸餾水定容至20ml。以1號管作為空白調零點,在540nm波長下比色測定。以麥芽糖含量為橫座標,吸光度值為縱座標,繪制標準曲線.
(二)酶液制備:稱取1g萌發3天的小麥種子(芽長約1cm),置于研缽中,加少量石英砂和2ml蒸餾水,研磨成勻漿。將勻漿倒入離心管中,用6ml蒸餾水分次將殘渣洗入離心管。提取液在室溫下放置提取15~20min,每隔數min攪動1次,使其充分提取。然后在3000rpm下離心10min,將上清液倒入100ml容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,搖勻,即為原液。吸取上述原液10ml,放入50ml容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,即為稀釋液。
(三)酶活力的測定:取6支干凈的具塞刻度試管,編號,按表(詳教材)進行操作。
(四)結果計算:活力=C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min)。式中,C為從標準曲線上查得的麥芽糖含量(mg);VT為原液總體積(ml);Vs為反應所用原液體積(ml);W為樣品重量(g);t為反應時間(min)。