【原理】
在含有特異抗體的瓊脂板中打孔,并在孔中加入定量的抗原,當(dāng)抗原向周圍擴(kuò)散后與瓊脂中抗體相結(jié)合,既形成白色沉淀環(huán),其直徑或面積與抗原濃度呈正相關(guān)。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)抗原或參考蛋白制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可用以定量檢測未知標(biāo)本的抗原濃度(mg/ml或IU/ml)。
應(yīng)用這一實(shí)驗(yàn)方法可檢測正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的含量及正常值。
【材料】
1.示教部分:
2%離子瓊脂或生理鹽水瓊脂(內(nèi)含2‰NaN3)
標(biāo)準(zhǔn)馬抗人IgG血清(抗體)(北京生物制品研究所生產(chǎn))
參考蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)(北京生物制品研究所生產(chǎn))
pH7.2 PBS
玻璃板或載玻片。
打孔器(孔徑3mm)及打孔模板。
微量加樣器
濕盒(容器內(nèi)加濕紗布或泡沫塑料)
2.實(shí)驗(yàn)部分:
已制備好的含有馬抗人IgG抗體的1%瓊脂板。
1:50稀釋的單人份待檢血清標(biāo)本。
打孔器、模板、微量加樣器及濕盒等。
【方法】
(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:示教
1.按照玻片的大小,以能制做1~1.5mm厚度的瓊脂板的量,分裝其1/2量的2%鹽水瓊脂。例如,用普通載玻片制做時(shí)其1%瓊脂量為4ml,在分裝2%鹽水瓊脂時(shí)既為2ml。溶化后置56~60℃水浴中平衡溫度備用。
2.稀釋抗體:將標(biāo)準(zhǔn)抗人IgG抗體按其效價(jià)用pH7.2 PBS做成1倍稀釋。例如,血清效價(jià)為1:140,原濃血清既應(yīng)稀釋為1:70。并分裝試管,其分裝量應(yīng)與2%鹽水瓊脂量相等。
3.制板:將已稀釋的抗人IgG抗體于56℃水浴中預(yù)熱約半分鐘,再傾注于已溶化并維持56~60℃的2%鹽水瓊脂管中,用拇指將管口堵緊。翻轉(zhuǎn)試管1~2次,將抗體與瓊脂混合均勻(注意:抗體與瓊脂混合時(shí)切勿產(chǎn)生氣泡),迅速傾注于玻片上,待凝固后既制成。
4.打孔:將瓊脂板置于模板上,在同一直線上用打孔器打孔5個(gè),孔距10mm。
5.稀釋不同濃度的參考蛋白標(biāo)準(zhǔn)(工作標(biāo)準(zhǔn)):應(yīng)根據(jù)制品說明進(jìn)行稀釋,例如:工作標(biāo)準(zhǔn)中免疫球蛋白含量,IgG為100單位/ml,80.4微克/單位,其稀釋范圍為1:10、1:20、1:40、1:80及1:160。
6.加樣:將已稀釋的不同濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)順序用微量加樣器每孔加入10μl(注意:每一稀釋度均應(yīng)更換塑料吸頭)。
7.置濕盒中,放37℃溫箱,24小時(shí)后觀察結(jié)果。
8.用量角規(guī)測量并記錄沉淀環(huán)直徑,然后以沉淀環(huán)直徑為縱座標(biāo),不同單位/ml為橫座標(biāo),繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在制做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),為盡量減少誤差,至少應(yīng)做兩份以上標(biāo)準(zhǔn)板。
(二)正常人血清中IgG值的測定:
1.將已制備好的抗體瓊脂板置打孔模板上,每一瓊脂板可打孔4個(gè)(孔徑3mm,孔距10mm)。
2.將單份正常人血清用pH7.2 PBS分別作1:50稀釋。
3.用微量加樣器分別取1:50稀釋的單人份血清標(biāo)本10μl加入孔中,每份標(biāo)本應(yīng)各加兩孔(每份標(biāo)本均應(yīng)更換塑料吸頭)。
4.作好標(biāo)記置濕盒中,放37℃溫箱,24小時(shí)后觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
測量各份標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑并記錄結(jié)果,然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線測出每份標(biāo)本所含IgG的單位/ml,并換算為mg/ml。
將全班實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出統(tǒng)計(jì)及均值,并寫出較完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。