儀器用具:
37℃培養箱及冰浴
Electroporation cuvette (electrode gap, 0.1 cm)
Electroporator (Bio-Rad, IBI geneZapper 或其它廠牌)
藥品試劑:
無菌水 (置冰浴中)
10% glycerol (置冰浴中)
SOB 液體培養基
SOB 固體培養基
SOC 液體培養基
SOC/Amp 固體培養基
大腸桿菌JM109
Ligation mixtures
方法步驟:
菌體的處理:
1) 進行轉形實驗的前16~20 h,將菌種JM109 接種在SOB 固體培養基上,并在37℃培養箱中培養。
34 Methods in Biotechnology Vol 1
2) 取80 mL SOB培養基裝入250 mL滅過菌的三角瓶。 另取1 mL SOB加于微量離心管中。由SOB固體培養基上選8 個約2~3 mm大小的單一菌落接入1mL SOB中,震蕩將菌體打散后,加入80 mL SOB中,于37℃震蕩培養約2~3h,直至細胞數約為4~7×107/mL.
3) 收集菌液于離心管中,置冰浴中10 min.
4) 以750~1,000 g 離心12~15 min (4℃)。
5) 倒去上清,并盡量將液體倒干,或以微量移液器頭吸干凈。
6) 沉淀加入80 mL 冰冷的無菌水,稍加震蕩,混合均勻后以750~1,000 g 離心12~15 min (4℃)。
7) 倒去上清,菌體再依序以40 mL 及1.6 mL 無菌水同法處理。
8) 菌體以0.16 mL 冰冷的10% glycerol 懸濁。
9) 菌液每80 μL分裝一管,可直接用于electroporation,或以液態氮或干冰快速凍結后置 -70℃貯存。
Electroporation:
1) 進行electroporation 的DNA 樣品溶液中離子強度不可過高,DNA 需先經過透析或以酒精沉淀處理。透析可如2.3.1 節步驟15) 進行。
2) Cuvettes 自包裝中取出后,置冰浴中至少5 min.
3) 將菌液置于冰浴中,加入DNA 樣品,混合后,小心將溶液吸至cuvette 的凹槽中,將cuvette 置冰浴中。
4) 進行electroporation 時,將cuvette 由冰浴中取出,將四周水份擦干,置于反應槽中,并接上電極線。
5) 以2.5 kV, 21 μF 進行electroporation.
◆ 注意!高電壓!
6) 取出cuvette,立即加入1 mL SOC.
7) 吸出菌液移至微量離心管中,于37℃震蕩培養45 min.
8) 取200 μL 菌液涂布于SOC/Amp plate.置37℃培養16~20 h.
9) 觀察plate 上菌落的形狀并計算菌落數。