一、限制與修飾（Restriction and modification）

1.限制與修飾現象

早在 50 年代初，有許多學者發現了限制與修飾現象，當時稱作寄主控制的專一性（host controlled specificity）。 l 噬菌體表現的現象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉染頻率可說明這一問題（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時會受到限制。

E.coli 菌株 λ噬菌體感染率 

lK lB lC 

E.coli K 1 10-4 10-4 

E.coli B 10-4 1 10-4 

E.coli C 1 1 1 

說明 K 和 B 菌株中存在一種限制系統，可排除外來的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修飾系統作用的結果，此時限制系統還未起作用。而在 C 菌株不能限制來自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用實際就是限制酶降解外源 DNA ，維護宿主遺傳穩定的保護機制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤 A 成為 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成為 5' 甲基胞嘧啶。通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。2.限制酶的發現

在 20 世紀 60 年代，人們就注意到 DNA 在感染宿主后會被降解的現象，從而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，從 E.coli K 中分離到限制酶，它有特定的識別位點但沒有特定的切割位點，其中切割位點離識別位點達 1000bp 以上。

1970 年，美國約翰·霍布金斯大學的 H. Smith 于偶然中發現，流感嗜血桿菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌體 DNA ，其細胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，從而找到 HindⅡ 限制性內切酶。 HindⅡ 限制性內切酶位點和切割位點如下：

5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '

3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '

從此以后，發現的限制酶越來越多，并且許多已經在實踐中得到應用。 EcoRⅠ 是應用zui廣泛的限制性內切酶，酶切位點和切割位點如下：

5' G↓AATTC 3'

3' CTTAA↑G 5'

限制性內切酶的命名遵循一定的原則，主要依據來源來定，涉及宿主的種名、菌株號或生物型。命名時，依次取宿主屬名*字母，種名頭兩個字母，菌株號，然后再加上序號（羅馬字）。如 HindⅢ 限制性內切酶， Hin 指來源于流感嗜血桿菌， d 表示來自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序號。以前在限制性內切酶和修飾酶前加 R 或 M ，且菌株號和序號小寫。但現在限制性內切酶名稱中的 R 省略不寫。

1986 年下半年發現 615 種限制酶和 98 種甲基化酶; 1998 年發現 10000 種細菌或古細菌中存在 3000 種酶，且酶有 200 多種特異性。到 2005 年 1 月，共發現 4342 種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 種，包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 種，甲基化指導的限制酶有 3 種，商業化的限制酶有 588 種，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 種特異性。

3.限制與修飾系統的種類

根據酶的亞單位組成、識別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統至少可分為四類。表 2-2 是各種限制與修飾系統的比較。

Ⅱ 型（type Ⅱ）限制與修飾系統所占的比例zui大，達 93% 。 Ⅱ 型酶相對來說zui簡單，它們識別回文對稱序列，在回文序列內部或附近切割 DNA ，產生帶 3'- 羥基和 5'- 磷酸基團的 DNA 產物，需 Mg2+ 的存在才能發揮活性，相應的修飾酶只需 SAM 。識別序列主要為 4-6bp ，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數酶識別更長的序列或簡并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。

Ⅱs 型（type Ⅱs）限制與修飾系統，占 5% ，與 Ⅱ 型具有相似的輔因子要求，但識別位點是非對稱，也是非間斷的，長度為 4-7bp ，切割位點可能在識別位點一側的 20bp 范圍內。

Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚體（homodimer），由兩個彼此按相反方向結合在一起的相同亞單位組成，每個亞單位作用在 DNA 鏈的兩個互補位點上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個甲基轉移酶來完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。

在 Ⅱ 型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，造成一個切口，這類限制酶也稱切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。

Ⅰ 型（type Ⅰ）限制與修飾系統的種類很少，只占 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亞基和 M 亞基） 各作為一個亞基存在于酶分子中，另外還有負責識別 DNA 序列的 S 亞基，分別由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因編碼，屬于同一操縱子（轉錄單位）。 EcoK 編碼基因的結構為 R2M2S 。 EcoB 編碼基因的結構為 R2M4S2 。

EcoB 酶的識別位點如下，其中兩條鏈中的 A 為甲基化位點， N 表示任意堿基。

TGA*（N）8TGCT

EcoK 酶的識別位點如下，其中兩條鏈中的 A 為可能的甲基化位點。

AA°C（N）6GTGC

但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位點在識別位點 1000bp 以外，且無特異性。

Ⅲ 型（type Ⅲ）限制與修飾系統的種類更少，所占比例不到 1% ，如 EcoP1 和 EcoP15 。它們的識別位點分別是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位點則在下游 24-26bp 處。

在基因操作中，一般所說的限制酶或修飾酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系統中的種類。

表2-2：各種限制與修飾系統的比較

 Ⅱ Ⅰ Ⅲ 

酶分子 內切酶與甲基化酶

分子不在一起 三亞基雙功能酶 二亞基雙功能酶 

識別位點 4-6bp, 大多數為回文對稱結構 二分非對稱 5-7bp 非對稱 

切割位點 在識別位點中或靠近識別位點 無特異性，至少在識別位點外 1000bp 在識別位點下游 24-26bp 

限制反應與甲基化反應 分開的反應 互斥 同時競爭 

限制作用是否需用 ATP No Yes Yes 

二、限制酶識別的序列

1.限制酶識別序列的長度

限制酶識別序列的長度一般為 4-8 個堿基，zui常見的為 6 個堿基（表2-3）。當識別序列為 4 個和 6 個堿基時，它們可識別的序列在*隨機的情況下，平均每 256 個和 4096 個堿基中會出現一個識別位點（44=256，46=4096）。以下是幾個有代表性的種類，箭頭指切割位置。

4 個堿基識別位點：Sau3AⅠ ↓GATC

5 個堿基識別位點：EcoRⅡ ↓CCWGG

NciⅠ CC↓SGG

6 個堿基識別位點：EcoRⅠ G↓AATTC

HindⅢ A↓AGCTT

7 個堿基識別位點：BbvCⅠ CC↓TCAGC

PpuMⅠ RG↓GWCCY

8 個堿基識別位點：NotⅠ GC↓GGCCGC

SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC

以上序列中部分字母代表的堿基如下。

R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C

K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T

H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G

D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T

2.限制酶識別序列的結構

限制酶識別的序列大多數為回文對稱結構，切割位點在 DNA 兩條鏈相對稱的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的識別序列和切割位置如下。

EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT

CTTAA↑G TTCGA↑A

有一些限制酶的識別序列不是對稱的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。識別序列后面括號內的數字表示在兩條鏈上的切割位置。

AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG

GGC↑GAG GAGCA↑C

有一些限制酶可識別多種序列，如 AccⅠ 識別的序列是 GT↓MKAC ，也就是說可識別 4 種序列，其中兩種是對稱的，另兩種是非對稱的。 HindⅡ 識別的序列是 GTY↓RAC 。

有一些限制酶識別的序列呈間斷對稱，對稱序列之間含有若干個任意堿基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它們的識別序列如下。

AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG

GT↑CNNNGAC GANT↑C

3.限制酶切割的位置

限制酶對 DNA 的切割位置大多數在內部，但也有在外部的。在外部的，又有兩端、兩側和單側之別。切點在兩端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等;在兩側的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性與其它酶不同，它們在識別位點的兩端各切開一個斷點，而不是只產生一個斷點。切點在識別位點外側的還有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。

BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓

↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN

三、限制酶產生的末端

1.限制酶產生匹配粘端（matched ends）

識別位點為回文對稱結構的序列經限制酶切割后，產生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。若在對稱軸 5' 側切割底物， DNA 雙鏈交錯斷開產生 5' 突出粘性末端，如 EcoRⅠ ;若在 3'-側切割，則產生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ 。

NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN

NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN

2.限制酶產生平末端（Blunt end）

在回文對稱軸上同時切割 DNA 的兩條鏈，則產生平末端，如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。產生平末端的 DNA 可任意連接，但連接效率較粘性末端低。

3.限制酶產生非對稱突出端

許多限制酶切割 DNA 產生非對稱突出端。當識別序列為非對稱序列時，切割的 DNA 產物的末端是不同的，如 BbvCⅠ ，它的識別切割位點如下。

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

有些限制酶識別簡并序列，其識別的序列中有幾種是非對稱的。如 AccⅠ ，它的識別切割位點如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 為非對稱。

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG

有些限制酶識別間隔序列，間隔區域的序列是任意的，如 DraⅢ 和 EarⅠ

4.同裂酶（isoschizomer）

識別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點可能不同。具體可分為以下幾種情況。

① 同序同切酶 這些酶識別序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 與 HincⅡ 識別切割位點為 GTY↓RAC ， HpaⅡ 與 HapⅡ 識別切割位點為 C↓CGG ， MobⅠ 與 Sau3AⅠ 識別切割位點為 ↓GATC 。

② 同序異切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 識別的序列是相同的，但它們的切割位點不同，分別為 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外， Asp718Ⅰ 識別和切割位點為 G↓GTACC 。

③“同功多位”許多識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如 EcoRⅠ 識別和切割位點為 G↓AATTC ， ApoⅠ 識別和切割位點為 R↓AATTY ，后者可識別前者的序列。另外， HpaⅠ 和 HincⅡ 的識別位點也有交叉，它們的識別和切割位點分別為 GTT↓AAC 和 HincⅡ 。

④ 其它有些限制酶識別的序列有交叉，如在 pUC 系列質粒的多克隆位點中有一個 SalⅠ 位點（識別切割位點為 G↓TCGAC），該位點也可被 AccⅠ（識別切割位點為 GT↓MKAC）和 HincⅡ（識別切割位點為 GTY↓RAC）切割。

5.同尾酶

許多不同的限制酶切割 DNA 產生的末端是相同的，且是對稱的，即它們可產生相同的粘性突出末端。這些酶統稱為同尾酶。這些酶切割 DNA 得到的產物可進行粘端連接。以下幾種酶產生的末端是相同的。通過表 4-3 很容易判斷哪些酶可產生相同的 DNA 末端。

·EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY

·SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA

·BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG

·ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）

6.識別特殊系列的 I-prefix 和 pI-prefix 系列酶

有些線粒體、葉綠體、核 DNA 、T 偶數噬菌體含有一些編碼內切酶的內含子，有些 intein （protein splicing element） 也有內切酶的活性，這兩類內切核酸酶稱為 I-prefix 和 pI-prefix 系列內切酶，它們識別的序列很長。 I-prefix 是由在 RNA 水平上剪切和編碼的， pI-prefix 在蛋白質水平上剪切的產物。這類內切酶也稱為 homing endonuclease ，目前商業化的種類有 6 種。從因特網上可以找到 Intein 的數據庫 Inbase（Intein Database），該由 New England BioLabs 公司維護（http://www.neb.com）。

I-CeuI 酶是衣滴蟲（Chlamydomonas eugametos）葉綠體大 rRNA 基因的內含子編碼的產物，識別位點為 26bp ，識別的核心部位為 -12 至 +7 位置的 19bp 。反應溫度為 37℃ ，識別位點如下，方框內為核心識別序列。

TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA

四、DNA末端長度對限制酶切割的影響

限制酶切割 DNA 時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數量的核苷酸，否則限制酶將難以發揮切割活性。

用 20 單位（Units）限制酶切割 1mg 標記的寡核苷酸做測試時，發現不同的酶對識別序列兩端的長度有不同的要求（表 2-4）。相對來說， EcoRⅠ 對兩端的序列長度要求較小，在識別序列外側有一個堿基對時在 2 小時的切割活性可達 90% 。而 AccⅠ 和 HindⅢ 對兩端的序列長度要求較大。

表2-4：靠近DNA，片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測） 

限制酶 待測的寡核苷酸序列 待測的寡核苷酸序列 

2hr 20hr 

AccⅠ CCGGTCGACCGG 0 0 

HindⅢ CAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG 0

0

10 0

0

75 

EcoRⅠ GGAATTCC >90 >90 

PstⅠ GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）20 0

10

>90

0 0

10

>90

0 

用 DNA 片段（線性載體）檢測末端長度對切割的影響時，同樣發現識別序列的末端長度對酶切效率有明顯影響，不同的酶對末端長度的要求是不同。

在設計 PCR 引物時，如果要在末端引入一個酶切位點，為保證能夠順利切割擴增的 PCR 產物，應在設計的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數目。另外，了解末端長度對切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點時選擇酶切秩序。

五、位點偏愛（Site preference）

某些限制酶對同一介質中的有些位點表現出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現出不同的切割效率的現象稱作位點偏愛。

某些噬菌體 DNA 中的某些相同的酶切位點對酶的敏感性是不同。λ 噬菌體 DNA 為 48502bp ，含 12bp 粘端。 EcoRⅠ 酶切割 l 噬菌體中的 5 個位點時并不是隨機的，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快 10 倍; EcoRⅠ 對腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切點的切割速率也不同。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 在 l 噬菌體 DNA 中的切割速率分別有 10 倍和 14 倍的差異。 l 噬菌體 DNA 有 4 個 SacⅡ 位點，三個在，一個在右臂，對三個位點的酶切速度快 50 倍。在 φX174 噬菌體 （單鏈環狀， 5386bp ， DNA 復制時可以雙鏈形式存在） DNA 中發現 HgaⅠ 切割某些位點比其它的快。在腺病毒 2 中， CTCGAG 位點對 PaeR7Ⅰ *抵抗，但同裂酶 XhoⅠ 卻很易切割，原因是 5' 末端有一個 CT 二核苷酸，與甲基化*無關。

造成上述現象的原因有以下幾種情況。 NarⅠ ， NaeⅠ 和 SacⅡ 三種酶屬于在切割 DNA 之前需要同時與兩個識別位點作用的一類酶。 BspMⅠ、EcoRⅡ 和 HpaⅡ 則屬另一種情況，它們對要求作用的 DNA 序列上有兩個明顯不同的結合位點，其中一個是為 DNA 切割激活另一個的變構位點（allosteric）。這兩序列可由順式（cis）方式提供，即相互靠近或形成環（loop）;或由反式（trans）方式提供，其變構位點由含識別序列的寡核苷酸提供。

六、酶切反應條件

1.緩沖液

常規緩沖液一般包括提供穩定 pH 值的緩沖劑、 Mg++ 、 DTT（二硫蘇糖醇）以及 BSA（小牛血請白蛋白）。

pH 經常為 7.0-7.9（在 25℃ 時），用 Tris-HCl 或乙酸調節; Mg++ 作為酶的活性中心，由 MgCl2 和 MgAc 提供; 濃度常為 10mM ;DTT 濃度常為 1mM 。有時緩沖液中還要加入 100mg/ml BSA ，但只是少數反應需要。不同的酶對離子強度的要求差異很大，并依次將限制酶緩沖液按離子強度的差異分為高、中、低三種類型，離子強度以 NaCl 來滿足，濃度分別為 100mM 、50mM 和 0mM 。

要對 DNA 進行雙酶切時，如何選擇緩沖液是相當重要的。一方面可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液;若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量 NaCl 和第二種酶;或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA 可純化或不純化）。

2.反應溫度

反應溫度大多數為 37℃ ，一部分為 50-65℃ ，少數 25-30℃ 。高溫作用酶在 37℃ 下的活性會下降，多數僅為zui適條件下的 10-50% 。如 Taq 限制酶（正常反應溫度為 65℃），在 37℃ 只有在 65℃ 活性的 10% ; ApoⅠ（正常反應溫度為 50℃）， 37℃ 只有在 50℃ 時活性的 50% 。銷售商在產品說明中都會標明*反應溫度。

3.反應時間

反應時間通常為 1 小時或更多，許多酶延長反應時間可減少酶的用量。 EcoRⅠ 若反應 16 小時，所需酶量為正常酶切時間的 1/8 ，即若反應時間為 16 小時，則所用酶量為只切 1 小時的 1/8 。其它一些酶也有類似情況，如HindⅢ為1/8;KpnⅠ為1/4;BamHⅠ為1/2。

4.終止酶切的方法

EDTA 可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應，終止濃度為 10mM ;加熱是常用的方法，對于*反應溫度為 37℃ 的酶，在 65℃ 或 80℃ 處理 20 分鐘可使酶活性大部分喪失。但是對于在 80℃ 作用 20 分鐘也有不失活的酶，如*反應溫度為 37℃ 的酶 Bg1Ⅱ、HpaⅠ 和 PvuⅡ ， 65℃ 酶 Tth111Ⅰ 和 TspRⅠ ，以及 50℃ 酶 Bc1Ⅰ ，可用抽提去除蛋白，或用試劑盒純化 DNA 。

七、星星活性（star activity）

在非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。實際上星星活性是限制性內切酶的一般性質，任何一種限制酶在非標準條件下都能切割非典型位點，如 ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssH11、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ 和 XmnⅠ 等酶皆可表現出星星活性。星星活性在絕大多數情況下是可控制的。

限制酶的特異性變化方式與酶的種類和所用的條件有關，zui普遍的活性變化來自 1 個堿基的變化、識別位點外層堿基的隨意性，以及單鏈缺口。

引起星星活性的因素有油濃度高（>5%），酶過量（>100U/ml），離子強度低（<25mM）， pH 值過高（>8.0），或是加了有機溶劑如 PMSD （二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、 sulphalane 等等，或是用其它二價陽離子如 Mn++ 、Cu++、Co++ 或 Zn++ 代替了 Mg++ 。但不同的酶對上述條件的敏感性不一樣，如 PstⅠ 比 EcoRⅠ 對高 pH 更敏感，但后者對油濃度更敏感。

抑制星星活性的措施有許多，如減少酶的用量（可避免過份酶切），減少油濃度，保證反應體系中無有機溶劑或乙醇，提高離子強度到 100～150mM （如果不會抑制酶的活性的話），降低反應 pH 至 pH7.0 ，以及保證使用 Mg++ 作為二價陽離子。

八、單鏈 DNA 的切割

部分切割雙鏈 DNA 的酶也可消化其單鏈，但是切割效率不同。 HinPⅡ、HhaⅠ、MnlⅠ 切割單鏈 DNA 的效率是切割雙鏈的 50% ， HaeⅢ 切割單鏈 DNA 的效率是切割雙鏈的 10% ， BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ 切割單鏈 DNA 的速度比切割雙鏈慢 100 倍。還有一些酶不切割單鏈 DNA ，如 AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、HphⅠ、MobⅠ、MobⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ、SfaNⅠ 等等。

有些限制酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，產生單鏈缺口，即切口酶（nicking enzyme），如 N.BstNBⅠ。這類酶在命名時前面要加一個 N 。目前已經商品化的這類酶共有 7 種。 N.BstNBⅠ 的識別序列和切割位置如下。

5′... G A G T C N N N N N ...3′

3′... C T C A G N N N N N ...5′

九、酶切位點的引入

在酶切水平上，通過酶切和連接可產生新的酶切位點。

（1）將產生的 5' 突出端補平后，再連接可產生新的酶切位點。 EcoRⅠ 的識別位點是 GAATTC ，先用它來切片段，將 5' 突出端補平后，再連接可產生 XmaⅠ（GAANNNNTTC）和 AceⅠ（ATTAAT）酶切位點，而 EcoRⅠ 的酶切位點消失。

……G AATTC…… 補平 ….GAATT AATTC…. 連接 ….GAATTAATTC…

……CTTAA G…… ….CTTAA TTAAG…. ….CTTAATTAAG…

對 HindⅢ 位點（AAGCTT）來說，經酶切和連接可產生 AluⅠ 和 NheⅠ 酶切位點，同時 HindⅢ 位點消失。

（2）同尾末端的連接。不同的同尾酶切割 DNA 產生的末端再相互連接時，可產生新的酶切位點，同時原來的酶切位點卻消失。例如 BamHⅠ（G↓AATCC）+ BclⅠ（T↓GATCA）→ AlwⅠ（GGATC 4/5），又如 XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或 NheⅠ 或 SpeⅠ 或 StyⅠ（CCTAGG）→ BfaⅠ（C↓TAG） 也產生了新的酶切位點。

（3）平端連接。平末端的限制酶切割的DNA在連接后也可產生新的酶切位點，例如 PvuⅡ（CAGCTG）+ EcoRV（GATATC）→ MobⅠ（GATC）。

十、影響酶活性的因素

影響酶切活性的因素有許多，概略的說可分為外因和內因。外因是可預見和控制的，如反應條件、底物的純度（是否有雜質、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當、反應體積的選擇以及反應時間的長短等等。內因包括位點偏愛性、甲基化底物、底物的構象。構象的影響主要指切割線性 DNA 和超螺旋 DNA 時的活性，如與切割 lDNA 相比， EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ 需要至少 2.5-10 倍的酶來切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRTⅠ 與 XhoⅠ 切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果 5' 端為 CT 則 PaeRTⅠ 不能切割。

十一、酶切位點在基因組中分布的不均一性

在基因組中堿基對的排列是非均勻的，因此盡管有的酶切序列中 GC 含量相同，但在基因組中出現的機率還是不一樣。如在 E.coli 中， AsoⅠ（GGCGCGCC）切點平均 20kb 中出現一個，而 NotⅠ（GCGGCCGC） 切點平均 200kb 中出現一個（常利用它出現的機會少來構建圖譜）， EcoRⅠ 和 HindⅢ 切點平均 5kb 中出現一個，而 SpeⅠ（ACTAGT） 切點平均 60kb 中出現一個。