1. 準備工作

俗話說用欲善其事，必先利其器。我強烈建議大家在做構建之前先找好工具，這樣起的效果事半功倍。這里說個笑話，我們系有個新PHD學生，是個印度女孩，很聰明很刻苦，她所在的實驗室也很好，不過除了她之外包括老板在內都是生物物理背景的，以前一個生物POSTDOC在的時候還好，這個POSTDOC一走，整個實驗室對分生就只有一個粗淺的概念，這個女孩就想把一個質粒上的基因插到另一個質粒上去，要是我就先查查有沒有合適的酶切位點，要沒有就改造一下質粒一切搞定，這女孩她不懂啊（要命的是她老板固然牛，對這方面也不懂），自己辛辛苦苦設計了PCR引物去做PCR，P了將近5K的產物去測序，結果測的結果中間有個MUTATION，要懂行的就找找酶切位點，從原來的替換上去，然后測這下這段就行。她呢，又送去了若干了質粒一個接一個的測，一個測序反應這邊是8刀,一個質粒測下來就是40刀，她光測序就要花好幾百刀（你得佩服老美實驗室真有錢呀）。

這件事教育我們準備工作是多么重要。

這里大家兩個工具，一個都知道，PRIMER5.0。另一個工具*大，也不知道國內流行不，叫lasergene，包括設計引物到構建圖譜，圖譜非常漂亮，而且分析酶切位點等等就超NB，如果感興趣的話我可以給大家傳一個圖譜看看。

2. PCR

如果沒有現成的質粒可供酶切，PCR是也是zui方便的策略。關于PCR具體技術壇子內帖很多，我不多說了，這里僅在構建方面談一談。

如何設計引物?

首先，看懂質粒圖譜!

拿大家比較熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1質粒，設計引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下來結果根本不表達融合蛋白，你就死了;C1質粒，注意frame，要是移碼了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚別弄竄了。一句話，要看懂你的圖譜!再多一句，PEGFP的XBA1和Bcl1位點不能用。

注意在設計酶切位點的時候要加保護堿基（大家要用T載體就當我沒說）。酶切位點設計也有一定的講究，我的原則是，能用粘端就用粘端，實在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如ECORV和SNAB1之類，要是以后還有別的用處就多加點酶切位點，我曾一口氣在引物上加了五個酶切位點以防以后要用到，注意計算TM的時候要減去這些不match的序列，或者選用touch-up策略。

除了酶切位點，還要注意KOZAK序列的問題，很多質粒沒有提供KOZAK序列，這要在設計的時候直接在引物上加好。

GENE OVERLAP也比較有用，比方說加個FLAG片段，HIS片段，2A序列之類的，直接設計三引物OVERLAP一下就可以，省得還要再多構建一步，這些都是設計引物時候就要考慮好的。

引物長一點不要緊（我zui喜歡兩步法了），尤其是對GC比高的序列，有時候引物不長PCR根本不出結果，注意如果GC比較高，這個時候GENE OVERLAP就不要做了，很麻煩，克隆很難挑。

沒有合適的酶切位點?

很簡單，用同尾酶策略，比方說Bgl2和BamH1,Nhe1和spe1，Xho1和Sal1（注意連上了切不下來），實在不行就平端吧，只要不超過4KB，平端酶連接也不那么難。

如何選擇Taq酶?

選擇Taq酶也很關鍵，首先，高保真（High fidelity）這是必須的，我在國內常用LA KIT，可這邊***忑貴，只好用（美）國貨。常用的PFU，PHUSION和PFX。PFX50是invitrogen公司的，一度曾賣到脫銷，保真性應該是目前zui高的，是普通Taq的50倍，對一般基因*問題（我同事4.5K PCR產物,居然一個突變都沒有），但是對比較難PCR的高GC或者位點比較難做PCR的基因（基因組為模板）就明顯不行了;PFU（安捷倫）保真性沒有PFX50高，但是能力很強，略貴點;phusion是NEB公司的，不貴，但是這個酶很怪異，每次用都要把annealing溫度調高好幾度，否則就出雜帶，個人覺得NEB內切酶是，但是Taq就不如Invitrogen了，如果實驗室有錢，直接買invitrogen的spuermix，什么都混好了，連ddH2o都搞定，只要直接向里加模版和引物就OK，每次我要拿漂亮的結果都用supermix。

還是那句話，讀說明書。同是高保真Taq酶，iproof 要求98度起始1min，pfx就要求95起始2min ，延伸有的是72，有的是68，有的要加1uL,有的加0.5，有的TM要低五度，有的高三度，這些必須要讀說明書，讀且仔細讀，這是拿到任何試劑都要做的*步。

如果基因太難PCR，怎么辦?

首先，DMSO是好物，好到甚至FISHER的Phusion就直接寫上了DMSO這項，注意3%-6%，太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片段過長的話，DMSO也不行，GC低的不。

我做個過一個2.8k,GC比高達92%的基因PCR，一共做了兩周，從保真性zui強的PFX50到普通的promega 2xGO Taq都試過，什么DMSO，甘油，Biorad的iproof with high GC Buffer, NEB one Taq 2x Taq High GC（還帶Enhancer的），TAKARA 的LA都試過，都不行，要么不出帶，要么就是亂七八糟的帶一起來，頭暈腦漲的我都打算抹平策略了，后來從別的實驗室弄來一個clontech的2 GC rich kit，一次搞定!強烈這個KIT，太牛了，在別家都繳械的時候，它一錘定音，不過價格也比別家都牛，10次反應就130刀，其實實驗室大可以備一個，就是防備超高GC又長的片段。不過這個KIT非高保真，送了三個克隆測序，各在不同部位有突變，于是我就從A克隆切一段接到B克隆上，又從C克隆切一段接B克隆上。注意的問題是GC比太高測序也很困難，正常GC能測1K左右，到了High GC就能測個五六百，這時要多準備些引物。

PCR產物的純化

如果帶很單一，又強，直接PCR產物純化就可以，如果有雜帶，但目的帶也很強，跑膠，目的帶切膠回收。回收這里也有個瓶頸，就是回收率的問題，我試過很多家的KIT，promega的GEL回收試劑盒效率和價格都很合適，這個。

關于T載體，我在國內的時候是*的，到了美帝反倒一次沒用過，這邊比較流行直接用PCR產物切，就是回收完了直接切上，回收后然后連接，這又回到了zui開始設計，要加保護堿基。這個策略好處就是免除了T載體這步，直接插入目的載體，存在的問題就是處于盲做狀態，還要加保護堿基。

3. 酶切

我的原則一向是：盡量避免PCR，能酶切的多酶切，實在沒辦法才去PCR。

這里強烈NEB的內切酶，還記得在有一次用別家的酶切過夜，結果質粒都被切碎了（當然當時質粒濃度也不高），而用NEB的酶，切個七十二小時仍舊一切OK，尤其現在NEB還推出了HF的內切酶，沒有星活性而且統一都用Buffer4，很好用，在國內我都用TAKARA的酶，基本上還可以。

注意要讀說明書，選用什么buffer，多少度，用不用加BSA，這些都要仔細讀。

酶切的起始量，PCR產物沒甚么可說的，全都切上，如果是從質粒上切片段，要根據你片段大小，片段適中，比如說7kb質粒，有2KB是目的片段，這時切個3-4ug就足夠了，如果只有0.2KB,那多切點，6ug-7ug　內切酶也沒問題。

4. 連接

zui常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用，但是注意Buffer里有ATP，反復凍融ATP失活得很快，這時有兩種辦法，一種是象我們chair實驗室，每次連接都統統朝里面加1uL ATP;另一種是我們實驗室的策略，拿到buffer就分裝，10uL/管，一次性使用，哪怕就用1uL，剩下的直接扔掉。

連接zui重要的注意事項，1，載體總量，2.載體和插入片段比例，3.載體和插入片段質量。

我在回收之后都要測載體濃度，一般來說，載體濃度在20-100ng/uL很好，太低的話碰撞幾率低，太高的話又會產生很多非目的克隆，總量從50-100ng就可以，太低失敗幾率很高，太高克隆太多，挑克隆會很麻煩，反應總體積也有講究，體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低，而且對感受態細胞也是個挑戰，通用10-15uL，我試過25uL沒有問題，40uL就不行了。

載體和插入片段比例一般是1:3，如果很難連接，比如說平端連接，要適當提高載體濃度，同時加大比例1:10，我試過一端平一端粘連接，4kb片段，4KB載體，連接成功率相當高，10個克隆里8個都是陽性的，但是7KB片段，5KB載體的平端連接就連試兩周都失敗，zui后換策略分兩段先后克隆進去的，這也給了我很深教訓，隔了一陣又做類似的實驗，這回我干脆連試都沒試，繼續分成兩段分別連進去的。

3片段連接同理，如果片段不太大，比方說小于3K，3片段連接成功幾率很高，但是如果你片段太大，就不行了，我試過4K載體，4K片段A，2K片段B連接，失敗四五次，zui后還是繞路走了。

5. 轉化

這個簡單遵循基本的準則就行，話說實驗室原來從sigma買感受態（competent cell），后來發現還是自己做的效率高，尤其在使用XL-10細菌的時比DH效率要高，需要的話我可以發protocol上來。要注意的是LB必須無菌而且沒有抗生素，實驗室原來有個volunteer，做一次失敗一次，我就奇怪了，后來才發現他用的居然是加了KANA的LB，直接暈過去了。還有就是氯化鈣的問題。氯化鈣吸水性很強，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里（反正我也不知道啥名字，就那種玻璃罐，干燥用的），大家要不放心，用之前可以把氯化鈣放在烘箱里烤一烤。

6. 鑒定

普通實驗做酶切鑒定，陽性率非常高，大多數情況下四個中起碼有三個是正確的，很多時候都是正確，這里一種叫fast digest的酶，切個十幾分鐘跑膠就行了。

如果找不到合適的酶切位點或者有其他問題，比方說有段時間我做個非常新潮的實驗，初始步驟的雖然是藍白篩選，但是白斑也大部分都不對，沒辦法鑒定就用菌液PCR，zui夸張的一次是五十個白斑里面居然就一個陽性的（沒辦法，該實驗特點），這要提質粒可提不起。菌液PCR也有講究，很多人做菌液PCR鑒定假陽性特多，為甚么?因為你PCR引物選的都在載體上，注意，引物必須分別在載體和插入片段上才準，PCR方法鑒定是極其準確的，我做過數百次菌液PCR，只要PCR條件正確，PCR和酶切結果對得上。PCR鑒定做起來也很簡單，拿個2mL tube，裝0.5mL 加入相應抗生素的LB，搖個三小時左后取1uL做模板就行了，樓下有個實驗室的POSTDOC特喜歡做直接的菌落PCR，我沒試過，效果怎樣不好說。

還要多說一句，要注意質粒是低拷貝還是高拷貝，普通的質粒一般4mL搖過夜，1.5mL就能提到500ng/uL　總體積40uL的質粒（根據試劑盒不同，zui高提過800ng/uL，也試過200ng/ul，都正常）。如果是低拷貝質粒，象PET系列和pshuttle系列，都是低拷貝，能拿到100ng/uL就已經很好了，這時候需要4ML菌當2ML提，但是zui要命的還是Adeasy 質粒（用來做腺病毒的），這個質粒超過30KB，普通KIT回收效率低到忍無可忍，一定要用特定的試劑盒才行，還是那句話，這些都要讀說明書。

7. 測序

我們拿到測序結果時候，不僅要核對具體的序列，而且要看測序圖，這很重要，因為有時候光看結果對，實際上圖顯示的不對，或者雖然結果不對，但是圖上出現的峰值本身就很怪異不可信，出現突變也不怕，有很大可能性是簡并密碼子，還要重點檢查的地方就是“接頭”的地方，因為偶爾引物會出錯，比方說少個堿基什么的，還有時候酶切之后連接也會丟一或者倆堿基什么的（這些問題我都碰到過），如果不仔細檢查到了后期悔之無及。

還要注意反向測序引物，尤其用到SV40，因為我用PEGFP這套質粒用習慣了，等換成大概是TET-ON那套系統，SV40正好是反過來的，我也沒留神，結果測回來的是載體……又吃了一次教訓。