PCR技術：樣品處理與注意事項

時間：2017/8/16閱讀：2234

一、樣品處理
DNA是染色體的主要組成部分，是PCR的擴增模板。要進行PCR，研究DNA結構與功能或者用于診斷目的，首先必須從生物體內提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色體DNA平均大小為3.0×109bp），提取DNA應盡量保持DNA完整性和純度，即在提取中盡量避免機械張力引起的DNA分子降解，又要注意雜質及蛋白的去除，防止胞內酶解DNA。因此，提取DNA的基本過程是：用Proteinase K及SDS，在EDTA存在下，裂解細胞，消化蛋白質，使核蛋白解聚及胞內DNA酶失活，然后用酚/多次提取去除蛋白質，在DNA中若混有少量RNA，可用RNase去除，zui后用乙醇沉淀得到DNA。

理論上PCR對模板DNA純度及完整性要求并不高，細胞經過熱變性使DNA釋出就可以作為模板，依賴引物的選擇性進行擴增。這對拷貝數很多的基因組，確實如此。但當待擴增的拷貝數甚少而無關細胞甚多時則擴增就不易成功，其原因是：①非希望的擴增增多，掩蓋了所需擴增的片段，使其數量減少至不能檢測到的程度。②生物樣品中的雜質會抑制pcr反應，zui主要的是血液和瓊脂糖。例如在100μl反應液中加入1μl全血就可引起抑制，0.8μmol/L的血紅素也會引起明顯的抑制。對于含血液的樣品，可以用滲透壓溶解紅細胞，離心集取細胞核，洗除血紅蛋白，再用蛋白酶/表面活性劑處理的方法來解決。另一簡單的方法是煮沸之，使釋放DNA，并沉淀Hb，用上清液作PCR。

現將PCR前處理各種標本的基本方法介紹如下：

1．所需溶液

（1）PBS 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0

（2）含表面活性劑及蛋白酶k的PCR緩沖液

50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2

0.1mg/ml明膠，0.45%NP40,0.45%吐溫20

高壓滅菌，冷凍儲存。臨用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K（水溶液）至100μl溶液中。

（3）溶血緩沖液

0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5

5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100

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PCR技術：樣品處理與注意事項

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