一、從原代組織中分離細胞 將組織塊分離(散)成細胞懸液的方法有多種，zui常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。

從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持zui大的活性。下列步驟可以解聚整個組織，獲得較高產量的有活性細胞。

1. (Trypsin)

●在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2到3次。

●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的中的(100mg組織加入1ml )。

●在4℃孵育6到18小時，使幾乎沒有活性的酶盡可能滲透進去。

●移棄組織碎片中的，在37℃孵育包含殘留的組織碎片20到30分鐘。

●在組織碎片加入熱的*培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基，要加入大豆抑制劑。

●通過無菌不銹鋼絲網(100～200mm)過濾，分散所有剩余組織。計數和接種細胞，進行培養。

2.膠原酶 (Collagenase)

●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks"平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。

●加入膠原酶(50～200單位/ml，溶解在HBSS中)。

●在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。

●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

●再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。

3.Dispase

●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的清洗組織碎片幾次。

●加入Dispase(0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的)

●在37℃孵育20分鐘到幾個小時。

●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

●通過離心在中清洗懸液幾次。

●再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。

二、從原培養容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞，且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應用，每一種系統條件和施用濃度應該根據經驗加以確定。

●再次培養時檢測細胞的活性。

●細胞的活率應該超過90%

●對于無血清培養基，降低使用量。

1. 移棄使用過的細胞培養基。

2. 使用不包含有鈣鎂的或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞(看表確定正確的清洗溶液)。在培養瓶對著細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。

3. 以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養瓶，輕輕搖動培養瓶。通常，在5到15分鐘內，細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過程，避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。

4. 當細胞*分離時，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入*培養基，通過移液管在單層細胞表面反復吹打來分散細胞。計數并再次培養細胞。

5. 對于無血清培養基，加入大豆抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml抑制劑到中將抑制活性。