一、試劑
1 、 10 × TBE ( pH 8.3 ):
2 、 46% 尿素溶液:
3 、 20% 聚丙烯酰胺溶液
4 、 10% 過硫酸胺
5 、引物
6 、模板
7 、 DNA 聚合酶
8 、放射性標(biāo)記的 dNTP 和 ddNTP 貯存液
9、TEMED
二、操作方法
(一)由雙鏈質(zhì)粒制備單鏈DNA膜板
取質(zhì)粒 DNA (溶于雙離蒸去離子水中) 8μl ( 1.5 ~ 2ug )
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加 2mol NaOH 2ul ,混勻后稍加離心,置室溫 10min
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加 3mol 乙酸鈉( pH5.2 ) 3μl
雙蒸去離子水 7μl
無水乙醇 60μl
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置液氮 10min ,離心 10min ( 13krpm ),
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加 70%乙醇洗1次,離心 ( 13krpm )
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棄上清,真空抽干,溶于 10ul雙 蒸去離子水中
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取樣,電泳鑒定
(二)聚丙烯酰胺/尿素膠制備:
將玻板洗凈,拭干; 70% 乙醇洗,涼干;內(nèi)層涂硅油,
重蒸水洗凈,吹干
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混合: 20% 聚丙烯酰胺液 20ml
10 × TBE 5ml
46%尿素 25ml
總計(jì)40ml過濾紙濾過
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加 10%過硫酸胺(AP)250μl;用雙蒸去離子水定容至100ml,混勻
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倒膠前加入 TEMED 50μl,混勻
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灌膠,待凝膠聚合后,將測序膠板安裝于測序電泳槽中
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電泳槽中加入 800ml1 × TBE
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預(yù)電泳
(三)DNA序列反應(yīng):
模板 DNA 10μl ; 4 只離心管上標(biāo)記
引物 2μl G 、 A 、 T 、 G 各管中
退火緩沖液 2μl 分別加入 2.5ul 的 ddNTP
總體積 14μl 終止混合液,蓋好蓋子。
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60℃ 10min 變性 37℃孵育1min
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標(biāo)記混合物 3μl
α-32P-dATP 1μl
稀釋的DNA聚合酶2μl
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混勻后置室溫5min
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每個反應(yīng)管4.5μl ↓
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37℃ 5min溫浴
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每管加入5μl 終止液
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混勻,置冰上
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上樣前75~80℃
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混勻,置冰上
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上樣前75℃~85℃加熱2min,隨即上樣
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依次為A、G、C、T,每孔上樣2~3μl
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40W恒功率下電泳,至溴酚藍(lán)走到底
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