我們開發(fā)、優(yōu)化了一種采用T7 RNA 聚合酶和退火的DNA寡聚核苷酸模板，體外合成短干擾RNA（siRNA）或發(fā)夾siRNA方法。在不同的哺乳動物系統(tǒng)中進(jìn)行的RNA干擾研究表明合成的siRNA是有功能的。體外有效、廉價地合成siRNA有助于快速篩選多個靶點，識別具有強(qiáng)烈沉默效應(yīng)的siRNA。
T7 RiboMax™ Express RNAi Syestem可用于體外快速、有效地合成siRNA或發(fā)夾siRNA，在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行RNA干擾研究。
前言
RNA干擾是一種雙鏈RNA（dsRNA）通過激活互補(bǔ)的靶mRNA的特異降解來抑制靶蛋白表達(dá)的現(xiàn)象（綜述見參考文獻(xiàn)1及其相關(guān)文獻(xiàn)）。RNA干擾是研究基因功能的有力工具，研究人員可通過敲除或下調(diào)靶蛋白的表達(dá)水平研究基因的功能。
RNAi涉及許多步驟，包括RNaseⅢ家族成員（如：果蠅的Dicer）識別dsRNA，并將其切割為21－23個核苷酸的siRNA (2-4)。siRNA整合成RNAi靶復(fù)合物RISC（RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物），從而破壞了復(fù)合物中與siRNA結(jié)構(gòu)同源的mRNA（3，4）。
在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中，引進(jìn)長鏈dsRNA（>30bp）可誘導(dǎo)潛在的抗病毒反應(yīng)，導(dǎo)致mRNA降解，并阻止蛋白合成（5）。然而，化學(xué)合成的siRNA在很多哺乳動物細(xì)胞中能誘導(dǎo)特異的基因沉默，而不引起非特異的抗病毒反應(yīng)（2，6）。zui有效的siRNA雙鏈長度為21個核苷酸，包括19bp的雙鏈序列，每個3"末端為2個的突出端（7）。
研究表明在體外可采用T7 RNA聚合酶成功合成有功能的siRNA和發(fā)夾siRNA（8，9）。采用T7RNA聚合酶合成siRNA的*要求是靶mRNA中含有GN17C序列，因為T7 RNA聚合酶偏愛核苷酸G作為轉(zhuǎn)錄起始位點（10）。
T7 RiboMax™ Express RNAi Syestem可用于體外快速、有效合成siRNA或發(fā)夾siRNA，在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行RNA干擾研究。另外，該系統(tǒng)也可合成較長的dsRNAs，用于許多非哺乳動物細(xì)胞的RNAi研究 (11)。和其它標(biāo)準(zhǔn)的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相比，該系統(tǒng)對緩沖體系、NTP濃度、T7RNA聚合酶、無機(jī)焦磷酸化酶及鎂離子水平進(jìn)行了優(yōu)化，RNA產(chǎn)率大大增加。
用RiboMax™系統(tǒng)合成siRNA
圖1顯示了采用T7 RiboMax™ Express RNAi 系統(tǒng)合成siRNA的流程圖。*步是合成DNA模板，即2條DNA寡聚核苷酸退火形成雙鏈，一般20μl體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要加入20 pmol雙鏈寡聚核苷酸。采用T7 RiboMax Express T7緩沖液和酶混合物可在30分鐘內(nèi)有效合成RNA。而后加入DNase消化除去DNA模板，而彼此分離的RNA單鏈可退火形成siRNA。這種單鏈小RNA可自身退火形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。采用醋酸鈉和異丙醇沉淀siRNA，產(chǎn)物溶解后可在聚丙烯酰胺凝膠上檢測產(chǎn)物的大小和完整性。用凝膠分析或RiboGreen(r)分析（Molecular Probes）對siRNA進(jìn)行定量分析。
