原理： 堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會*分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
儀器與主要試劑
儀器（見附錄）：
主要試劑： 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖
10 mmol/L EDTA
25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)
2毫克/毫升
溶液II： 200 mmol/L NaOH
1% SDS
溶液III： 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液
TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5
1 mmol/L EDTA
實驗方法：
1．將大腸桿菌菌落挑取一環(huán)接種在含有2毫升加入抗菌素的LB液體培養(yǎng)基的10毫升試管里，37℃振培過夜，16～18小時
2．轉(zhuǎn)移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm離心30秒
3．小心去除上清，并用吸水紙吸干殘余液體，再將沉淀物在振蕩器上振勻
4．加入溶液I 100μl，蓋緊EP管蓋，翻轉(zhuǎn)數(shù)次，冰上放置10分鐘
5．加入溶液II 200μl，溫和翻轉(zhuǎn)EP管5次(可觀察到溶液逐步由混濁變?yōu)橥该?，冰上放置5分鐘
6．加入溶液III 150μl，將EP管蓋緊后累累來回翻轉(zhuǎn)23次，混勻后冰上放置20分鐘
7．12000rpm離心15分鐘
8．將上清轉(zhuǎn)移到另一個EP管中(吸取時不可吸入底部的沉淀)。加入等體積的酚和氯仿：異戊醇各抽提一次
9．加入1毫升預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積的NaAc(3 mol/L,pH5.2)，蓋緊，并翻轉(zhuǎn)EP管數(shù)次混勻
10． 置于-20℃冰箱1～2小時
11． 15000rpm離心15分鐘，去除上清，收集管底白色沉淀
12． 70%乙醇洗滌一次，空氣干燥或真空抽干
13． 將沉淀溶于50μl TE緩沖液或去離子水，*溶解后，-20℃保存
14． 取樣5μl，在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察DNA條帶。
附注：
1．溶液Ⅰ--－溶菌液
：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中PH小于8時，作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械切力作用降解。
EDTA的作用：
（1） 螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時一定的金屬離子作輔基）。
（2）EDTA的存在，有利于的作用，因為的反應(yīng)要求有較低的離子強度的環(huán)境。
2．溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當pH>12或pH<3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液Ⅱ中的NaOH濃度為0.2mol/L,加抽提液時，該系統(tǒng)的PH就高達12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性.
SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3…R┿-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。
3．溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc(pH4.8)溶液
NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸.所以該溶液實際上是NaAc-Hac的緩沖液.用PH4.8的NaAc溶液是為了反pH12.6的抽提液,調(diào)回PH至中性,使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性,并能穩(wěn)定存在.而高鹽的3MOL/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA,RNA,以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之.前者是因為中和核酸上的電荷,減少相斥力而互相聚合,后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物,使沉淀更*.
