[實驗目的]

1. 學習血紅蛋白電泳分離方法；

2. 能辨認正常人和異常血紅蛋白的電泳圖譜；

[實驗原理]

血紅蛋白是一種結合蛋白質，由血紅素和珠蛋白組成。正常人所含珠蛋白的多肽鏈有a、b、d 、e、g和z六種。這六種肽鏈的基因在人體發育的不同階段表達狀況不一。正常成人紅細胞中有三種血紅蛋白即HbA、  HbA2 和 HbF。HbA（a2b2）是正常成人紅細胞中的zui主要的血紅蛋白，占紅細胞內血紅蛋白總量的96%以上，PI=6.7。 HbA2(a2d2) 是正常成人紅細胞中的次要成分，占2~3% 左右，其PI>6.7。 HbF(a2g2)為胎兒血紅蛋白，胎兒出生后六個月急劇持續下降至血紅蛋白總量的1%以下，其PI接近 6.7。各種血紅蛋白在pH8.5的緩沖液中均帶負電荷在電場中都向陽極移動，但因等電點不同所帶電荷數目不同而有不同的電泳速度。HbA因其所帶電荷zui多故向陽極泳動速度zui快，又因其含量zui多區帶顏色zui深。其后有一較淺的區帶為HbA2，HbF與HbA的等電點接近，通常與HbA分不開。

異常血紅蛋白是指由于基因突變而導致結構異常的紅蛋白。異血紅蛋白具有與正常血紅蛋白不同的電泳行為，因此用電泳的方法可以將其檢出。例如HbS是一種由b-鏈第6位的被所替換而形成的異常血紅蛋白，此變異體比HbA少帶兩個負電荷，因此，向陽極移動的速度比HbA慢，出現于HbA與HbA2之間。

分析血紅蛋白的電泳方法有許多，如濾紙電泳，淀粉膠電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。但異常血紅蛋白篩查zui常用的還是醋酸纖維薄膜電泳法。因為醋酸纖維薄膜做支持體電泳操作簡便，電泳速度快，分辨力強區帶集中而且對染料不吸附，容易定量。用醋酸纖維素薄膜電泳篩查異常血紅蛋白的檢出率為1~2‰。

[器材與試劑]

1.  器材、電泳儀、電泳槽、醋酸纖維素薄膜

2.  試劑

(1) 浸泡醋酸纖維膜TBE緩沖夜(pH8.5)；

(2) 電泳槽硼酸緩沖液(pH8.6；

(3)麗春紅染色液；

(4)漂洗液。

[步驟與方法]

1. 浸膜：將醋酸纖維素薄膜膜面向下放入浸膜液中，浸透后用子壓入液面底部。

2. 采血：碘伏消毒耳垂部，用一次性采血，并將血液吸在兩次對折的濾紙尖部。

3. 加樣：將浸泡好的醋酸纖維素薄膜膜面向上放在濾紙上，用濾紙吸去多余的液體，在距一側1.5cm處用沾血的濾紙涂圓點狀（直徑約0.2cm）或線狀。

4. 電泳：將加好樣的醋酸纖維素薄膜膜面向下放入電泳槽中的緩沖液紗布上，加樣端放在負極，靜置2分鐘后開啟電源，調電壓200伏，電泳40分鐘。

5. 電泳結束后，關掉電源，觀察電泳圖譜，并記錄紅色區帶（幾條）及分布（位置）情況。

6. 染色： 將醋酸纖維素薄膜放入染色液中2分鐘，然后轉入漂洗液中洗至背底呈白色，再觀察結果。

電泳對比圖譜

含異常血紅蛋白的樣品：應在未染色前觀察，除正常成分外，在任何位置出現的不經染色的紅色區帶，均可記為有異常血紅蛋白存在。異常血紅蛋白常以HbA為標準，分為快泳血紅蛋白和慢泳血紅蛋白。

[注意事項]

1. 醋酸纖維素膜一定要浸透（無白色斑點），加樣前從浸膜液中取出，既要吸去多余的液體還不能使膜太干，否則都會影響電泳結果。

2. 加樣時注意要加在醋酸纖維素的膜面，電泳時也要膜面向下放到電泳槽中的緩沖液紗布上。