【實驗目的】

1.掌握聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦的基本原理

2.學習用等電聚焦電泳測定蛋白質等電點的操作和方法

【實驗原理】

等電聚焦法是一種特殊的聚丙烯酰胺凝膠電泳法。它的特點是在凝膠柱中加入兩性電解質載體-Ampholine，從而使凝膠柱上產生pH梯度。當向兩性載體凝膠施加電場時，即可形成pH梯度，pH梯度的順序是從陽極到陰極pH值逐漸增大。

蛋白質為兩性電解質，其所帶電荷的性質和數量隨所處環境的pH而變化。當蛋白質在等電聚焦凝膠柱中進行電泳時，帶電荷的蛋白質離子即在凝膠柱上泳動：帶負電荷的蛋白質分子向陽極移動，帶正電荷的蛋白質分子向陰極移動。當蛋白質樣品泳動到凝膠的某一部位，這一部位的pH值正好相當于該蛋白質的等電點時，蛋白質的凈電荷為零不再移動，則聚焦形成一條蛋白質區帶。這種按等電點的大小在pH梯度某一相應位置進行聚焦的方法稱為等電聚焦。

利用這種方法，在蛋白質聚焦的相應位置測定凝膠的pH值，就可得知該蛋白質的等電點。

【實驗材料】

1.實驗器材

小玻璃管：內徑0.5cm，長10cm 2支；小玻管架；圓盤電泳槽；注射器和長針頭；移液管；pH計

2.實驗試劑

(1) 兩性電解質載體凝膠：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉雙丙烯酰胺0.1g，pH3一10的Ampholine 2.5ml，核黃素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。

(2) 蛋白質溶液：純牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸餾水。此蛋白溶液應無鹽離子。

(3) 5%磷酸溶液

(4) 2%氫氧化鈉溶液

(5) 考馬斯亮藍R-250染色液：稱取考馬斯亮藍R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。

(6) 40%蔗糖溶液

(7) 12%三氯醋酸溶液

(8) 脫色液：乙醇:冰醋酸:蒸餾水 = 25：10：65(v/v)。

【實驗操作】

1. 取4ml兩性電解質載體凝膠，置于抽氣瓶中，加入0.07ml蛋白質溶液，輕輕搖動混勻，抽去氣泡。

2. 取干凈的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3—4滴，然后吸取抽氣瓶中的兩性電解質載體-蛋白質混合液1.8ml緩緩放入玻璃管中，加入膠液后立即用注射器加上一薄層水（3-5mm高），使混合液表面與空氣隔絕。放置約0.5-1小時，觀察凝膠的凝聚情況。

3. 管內凝膠凝聚后，用濾紙將頂端水吸去，小心拔去管底橡皮塞，讓蔗糖溶液流出，并用少量蒸餾水清洗，然后將小玻璃管垂直放入圓盤電泳槽中。上槽加入5%磷酸溶液，接正極，下槽加入2% NaOH溶液，接負極，于150V條件下進行聚焦，過一段時間后（約2-3小時），電流穩定不變時（基本為零），說明聚焦完畢。

4. 聚焦結束后取出小玻璃管，迅速用蒸餾水將兩端洗凈。用一帶長針頭的注射器灌滿蒸餾水，并將針頭緊貼玻璃管內壁插至凝膠和管壁之間，轉動玻璃管，同時推動注射器，并使針頭在管壁與凝膠間前進，注入蒸餾水，使凝膠膠條從玻璃管中脫出。

5. 將其中一根凝膠膠條浸于12%三氯醋酸溶液中固定2小時，白色蛋白區帶即出現。再浸于考馬斯亮藍染色液中染色5小時。取出后，轉移至脫色液中脫去背景顏色。

6. 將另一根凝膠膠條按順序切成0.5cm長的小段，分別浸泡于1.0ml蒸餾水中過夜，用pH計測定pH值。

【實驗結果】

以凝膠膠條長度為橫座標，pH值為縱座標，作圖。

量出染色的各蛋白區帶的距離，對照曲線查出其等電點。

【思考】

1. 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳法測定蛋白質等電點的原理？

2. 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳法操作時應注意的問題？