-、甲基化特異PCR可能出現(xiàn)的問(wèn)題與對(duì)策 

1.  引物因素分析MSP的引物設(shè)計(jì)的質(zhì)量是擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵性因素。

MSP的引物設(shè)計(jì)與普通的PCR引物設(shè)計(jì)不同，MSP的引物設(shè)計(jì)原理是：模板DNA在經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽處理后，發(fā)生甲基化的基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島內(nèi)CpG位點(diǎn)5 一端胞嘧啶保持不變；而未發(fā)生甲基化的CpG島內(nèi)CpG位點(diǎn)5 一端胞嘧啶轉(zhuǎn)化為*，即C―U。針對(duì)修飾前后的序列差異用MethPrimer軟件設(shè)計(jì)甲基化與未甲基引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MSP的引物序列中至少含有1個(gè)以上CpG位點(diǎn)，是含有多個(gè)CpG位點(diǎn)，這樣可保證引物的特異性，同時(shí)可以提高DNA啟動(dòng)子甲基化堿基的檢出率。 MSP的引物必須按亞硫酸氫鈉處理后的DNA序列設(shè)計(jì)，同時(shí)也應(yīng)該盡可能與普通PCR的引物設(shè)計(jì)原則相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP擴(kuò)增時(shí)，至少要合成2對(duì)引物，即甲基化引物與未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前導(dǎo)引物不含*堿基，反向引物不含胞嘧啶堿基。 初涉及MSP者用文獻(xiàn)引物進(jìn)行研究。如果是為了篩選新的甲基化的抑癌基因而文獻(xiàn)中無(wú)法找到的相應(yīng)MSP引物，可用在線MethPrimer軟件在線設(shè)計(jì)引物，根據(jù)軟件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困難是，要擴(kuò)增的是啟動(dòng)子或部分*外顯子序列，其CG含量相對(duì)較高，MSP擴(kuò)增難度加大，因此設(shè)計(jì)好的引物用引物軟件如Primer5．0從理論上推測(cè)其擴(kuò)增效率，對(duì)于擴(kuò)增效率<30％ 的引物要進(jìn)行優(yōu)化，方法是：在核心啟動(dòng)子區(qū)域前后反復(fù)調(diào)整甲基化前導(dǎo)引物擴(kuò)增起始點(diǎn)，以期使引物擴(kuò)增效率增高，降低擴(kuò)增難度，從而提高PCR產(chǎn)量。

2.  MSP的反應(yīng)體系問(wèn)題MSP的反應(yīng)體系的成分與普通PCR一樣，反應(yīng)體系的優(yōu)化也與普通類似，反應(yīng)體系的優(yōu)化與普通PCR的反應(yīng)體系中zui大的區(qū)別是DNA模板不同。

經(jīng)過(guò)修飾后的模板為單鏈狀態(tài)，MSP的DNA模板在抽提后應(yīng)檢測(cè)其純度和含量，其純度要求A260／A280在1．8～2．0之間； 其含量要準(zhǔn)確檢測(cè)，否則在亞硫酸鹽處理時(shí)因DNA模板加的太多而導(dǎo)致DNA處理不*而導(dǎo)致MSP擴(kuò)增失敗；而加的DNA模板太少則一方面浪費(fèi)試劑，另一方面會(huì)因?yàn)槟康钠翁賹?dǎo)致MSP假陰性。Mg“濃度一般在2．0～2．5 mmoL／L為宜，過(guò)低過(guò)高都不利于擴(kuò)增。此外，PCR的緩沖液及Taq酶的來(lái)源也很重要，一般的PCR緩沖液常常會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，不同來(lái)源的Taq酶也會(huì)影響結(jié)果的重復(fù)性。我們建議用Taka―ra公司針對(duì)富含CG等復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果較好。而一旦選用某一廠家Taq酶后，不要輕易更換，以免MSP因重新優(yōu)化而引起的時(shí)間和成本的浪費(fèi)。

3.  MSP的反應(yīng)溫度分析MSP擴(kuò)增的結(jié)果有3種情況：

（1）產(chǎn)物電泳為陰性；

（2）產(chǎn)物電泳出現(xiàn)多條非特異性條帶（含目的基因條帶）；

（3）產(chǎn)物電泳為陽(yáng)性（僅目的基因條帶）。出現(xiàn)前2種情況時(shí)，可在保證反應(yīng)體系和引物沒(méi)有問(wèn)題的情況下，通過(guò)調(diào)整MSP的反應(yīng)溫度而得到目的基因帶。方法如下：PCR反應(yīng)中，Tm的高低與CG含量呈正相關(guān)。因甲基化與未甲基化引物序列差異，在擴(kuò)增過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)PCR偏性。我們建議，提高預(yù)變性溫度（一般應(yīng)>95 °C，10 rain）和變性溫度（>95 ℃ ，1 min），退火溫度以60 ℃作梯度或70 ℃作降落PCR。

總之，在MSP全過(guò)程中，影響結(jié)果的因素較普通PCR要多得多，只要對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程每一步認(rèn)真控制可*提高M(jìn)SP的準(zhǔn)確度和精密度。

二、亞硫酸氫鈉修飾過(guò)程中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及應(yīng)對(duì)措施 

亞硫酸氫鈉修飾DNA的目的是將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶*轉(zhuǎn)化為*，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不變。影響此過(guò)程的主要因素有修飾試劑的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)環(huán)境的pH值及反應(yīng)時(shí)間。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都將導(dǎo)致MSP擴(kuò)增失敗，體會(huì)如下： 

1.  亞硫酸氫鈉的濃度控制在3.0～3.9 mol/L為好，其pH值必須用NaOH調(diào)整至5．0；

2.  修飾時(shí)間應(yīng)掌握在10～16 h，修飾時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致甲基化胞嘧啶也會(huì)轉(zhuǎn)化成*且DNA模板破壞加劇，而時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致修飾不*；

3.  反應(yīng)溫度應(yīng)控制在50～55 ℃（若用國(guó)產(chǎn)恒溫水浴箱建議溫度設(shè)定在53℃為好）；

4.  DNA模板量應(yīng)控制在<2 ug為宜。

只要遵循以上幾點(diǎn)基本上能保證99％ 未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化*，而甲基化的胞嘧啶保持不變。但是，此修飾過(guò)程中模板DNA有約96％已經(jīng)降解 。當(dāng)DNA樣品較少時(shí)（如石蠟包埋組織、血清DNA），在純化回收時(shí)可加人適量鮭魚(yú)精DNA或糖原（約1 g）作為載體，有利于DNA沉淀（加入載體后輕輕晃動(dòng)Ependof管可見(jiàn)絮狀DNA富集現(xiàn)象） 。