細(xì)菌中制備基因組DNA實(shí)驗(yàn)

時(shí)間：2016-4-12閱讀：141

真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。

實(shí)驗(yàn)方法原理	提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
實(shí)驗(yàn)材料	細(xì)菌
試劑、試劑盒	TE氯化銫溴化乙錠NaCl乙醇CTAB
儀器、耗材	離心機(jī)搖床
實(shí)驗(yàn)步驟	1. 培養(yǎng)5 ml 的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.5 ml 的培養(yǎng)物離心2 min。 2. 沉淀物加入567 μl 的TE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。 3. 加入30 μl10%的SDS和3 ℃ 20 mg/ml蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1 h。 4. 加入100 μl 5 mol/l NaCl充分混勻，再加入80 μlCTAB/NaCl溶液，混勻，于65℃溫育10 min。 5. 加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，離心4~5 min將上清液轉(zhuǎn)人一個(gè)新管中，如果難以移出上清，先用牙簽除去界面物質(zhì)。 6. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入一只新管中。 7. 加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，用一個(gè)封口的巴斯德管將沉淀轉(zhuǎn)移至1 ml 的70%乙醇中洗滌。 8. 離心5 min，棄上清，用凍干機(jī)稍加干燥，重溶于的下100 μl TE緩沖液，每次酶切反應(yīng)用10~15 μl。

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