制備DNA測序模板實驗
標簽： DNA 測序 模板
本實驗包含了用于制備適用于雙脫氧測序的模板及適用于末端標記和化學測序的DNA的實驗方案。所有用于雙脫氧測序的雙鏈模板在與引物退火前必須變性，在一般應用上，堿變性在測序中的效果比熱變性好。
- 制備單鏈M13噬菌體DNA
- 小量裂解物中制備λ噬菌體DNA
- 雙脫氧測序的雙鏈質粒DNA的堿變性
| 實驗材料 | 大腸桿菌 |
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| 試劑、試劑盒 | LBTEM13聚乙二醇容易讓頂層瓊脂乙酸鈉乙醇 |
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| 儀器、耗材 | 巴斯德吸管試管離心機 |
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| 實驗步驟 | 1. 如果起始用M13復制型DNA或M13單鏈DNA，以0.5 ng 重組M13mp復制型DNA或5~10 ng 單鏈DNA轉化40 μl 感受態大腸桿菌DH5αF'株，按熱休克方案進行轉化。
2. 轉化細胞加0.2 ml大腸桿菌DH5αF'過夜培養物后，混勻于3 ml H頂層瓊脂，傾倒于37℃平板，倒扣后置于37℃過夜。
3. 大腸桿菌DH5αF'過夜培養物以2×TY培養液稀釋100倍，分裝于18 mm×150 mm 試管，每份1.5 ml。
4. 用無菌巴斯吸管挑取M13mp 噬斑，并置于上述每份培養物中，要注意確保瓊脂塊已玻轉移。
5. 重復進行挑斑，在37℃生長細菌5~6 h。
6. 細菌培養物移至1.5 ml 微量離心管中，于4℃或室溫高速離心5 min，上清移至一個干凈的1.5 ml 微量離心管中。
7. 噬菌體上清加入200 μl M13 PEG溶液，混勻，于室溫放置15 min，高速離心5 min，棄上清。
8. 高速離心30 s，并以頭部已拉細的巴斯德吸管吸出殘余液體。
9. 以100 μl TE重懸沉淀，加入100 μl 緩沖液平衡酚，旋渦混合器輕輕振蕩15~20 s。
10. 于4℃或室溫高速離心5 min，轉移上上清水相于一個干凈的微量離心管中。
11. 加入11 μl 3 mol/l pH5.2的乙酸鈉和250 μl *乙醇，于-70℃冷凍20 min。
12. 4℃高速離心10 min，棄上清。
13. 加入100 μl 冰冷70%乙醇，微量離心，棄上清，重復此70%乙醇冼滌1次。
14. 在Speedvac真空旋轉蒸犮器中干燥沉淀。
15. 沉淀重溶于20 μl 緩沖液，取0.5 μl 在小型凝膠中電泳，以確證DNA的濃度。
16. 剩余貯于-20℃直到用作模板進行測序反應。
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