蛋白質純化技術服務

1、 蛋白質純化服務流程

① 原始材料的澄清;

② 目的重組蛋白的捕獲(GST、His標簽蛋白);

③ 破碎含有蛋白質的細胞;

④ 蛋白質粗提，清除雜質:去除核酸、原生質體、不溶物或者洗滌包涵體等;

⑤ 變性、濃縮;

⑥ 純化：離子交換層析、親和柱層析(帶標簽的融合蛋白)、凝膠過濾等;

⑦ 精制均一的目的蛋白;

⑧ 蛋白質純度鑒定;

⑨ 蛋白質含量測定。

2、 蛋白質純化的方法

蛋白質純化的現有方法范圍很廣，從19世紀簡單沉淀到復雜層析和親和技術。方法可被分成幾種不同的類別，如根據蛋白質的特點，可以將蛋白質純化方法分成明顯不同但又相互關聯的4組：表面特征、結構、凈電荷和生物學特性。

①基于蛋白質表面特征的方法：表面特征包括電荷分布和可及性、疏水氨基酸殘基鏈的表面分布以及在較少程度上蛋白質在某pH時的凈電荷。該法主要依賴于溶解度的特性，通過對溶解蛋白質的溶劑進行各種處理，使蛋白質的溶解度發生變化，從而引起沉淀，獲得含有大量可溶性目的蛋白提取物。在這組方法中還包括高度特異性的免疫親和層析技術，使用直接抗蛋白質表面上一個表位的抗體從混合物中將目的蛋白分離出來。

②基于整個結構(大小和形狀)的方法：利用蛋白質的大小和形態的分離主要采用凝膠過濾法。蛋白質大小的范圍很大，從zui小的分子質量約5000 Da的蛋白質(被分類為蛋白質，而不是肽)到幾百萬道爾頓的大分子物。許多蛋白質在具有生物活性的狀態下為寡聚體，由一個以上的多肽組成，這種寡聚體可以被解離。

③基于凈電荷的方法：利用蛋白質全部凈電荷的兩種技術是離子交換層析和電泳。離。離子交換劑結合帶電荷的分子，而且基本只有兩種離子交換劑：陰離子和陽離子。，離子交換劑由固定化的帶電基團組成，能夠吸引帶不同電荷的蛋白質，這些離子交換劑能夠提供對天然蛋白質具有zui高分辨率的分離(圖1)。

④基于生物學特性的方法(親和法)：從其他蛋白質中分離目的蛋白的一種強有力的方法是使用生物特異性的方法。除了從理論上能夠通過免疫親和層析進行純化蛋白質以外，親和法只局限于具有某種特異結合特性的蛋白質，免疫親和層析是所有親和技術中zui特異的。在親和層析技術中，將與蛋白質結合的配體(或能夠與蛋白質結合的抗體)固定化，則能夠選擇性地吸附目的蛋白(圖2)。

圖1 離子交換原理 圖2 親和層析原理

3、 蛋白質純化的原則

①確定zui終目的：確定zui終目的蛋白的純度水平和所需要的量;

②建立一種快速的分析方法：該方法可監控目的蛋白的純度，快速檢測目的蛋白的活性和每一步驟中的回收率，分析也應能容易地處理大量樣品;

③在預實驗中確定目的蛋白的化學特性和物理特性:如pI、大小、溫度穩定性和配基專一性等，以利于簡化分離技術的選擇和*化,可能的話，在每一純化階段采用不同的分離技術;

① 保持純化操作盡可能簡化：額外的步驟總會減少目的蛋白的產率，也會增加整個過程的時間;

② 每一步驟要處理盡量少的樣品：避免冗長的操作，否則可能會減少產率，導致生物活性的丟失;

③ 在純化操作的早期除去危險污染物，特別是蛋白酶;

④ 加穩定性添加劑要小心，如去污劑和鹽，因為可能需要在以后的純化步驟中除去這些添加劑，否則它們可能會干涉分析。

4、 材料要求

① 盡量選用新鮮的材料;

② 實驗材料涉及危險品，loogene公司不予服務;

③ 提供盡量詳細的實驗背景材料;

④ 大規模生產時，注意選含量高、來源豐富及成本低的原料;

⑤ 對預處理好的材料，若不立即進行實驗， 應冷凍保存。

5、 實驗周期

① 純化1～5mg蛋白質，20個工作日

② 純化5～10mg蛋白質，30個工作日

③ 純化10mg蛋白質以上，40個工作日

6、 提供結果

完整的實驗操作步驟、目的蛋白質純度鑒定(85%，90%，95%)、目的蛋白質含量鑒定等。