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上海金穗生物科技有限公司

質體DNA的小?分離法

時間:2013-2-21閱讀:403
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儀器用具:
微?離心機;冰浴

藥品試劑:
MP I (25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA, pH 8.0; 50 mM glucose)
MP II 新鮮配制 (0.2 N NaOH; 1% SDS; 使用前以10 N NaOH, 10% SDS稀釋混合配制)
MP III (3 M *溶液,pH 5.2,置冰浴中)
RNase A (1 mg/mL, 已經過100℃加熱30 min 以去除DNase 活性)
純酒?及70%酒?
TE-8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0)

方法步驟:
1) pBlueGus/JM109, pQE31/JM109 接種于含100 μg/mL ampicillin 的LB 培養基,于37℃震蕩培養過夜。
2) 取1.5 mL 菌液,加于微?離心管中,以6,000 rpm 離心2 min 后,倒去上清,以微?移液器頭盡可能吸去殘?液體。
◆ 兩種質體均請制備三管!
3) 沉淀加入0.1 mL MP I,劇?震蕩,將沉淀*打散。
4) 慢慢加入0.2 mL MP II,蓋上管蓋后將管子反復上下搖動,注意?可震蕩! 此時溶液應漸澄清且黏?增加;將離心管置冰浴中。
5) 加入0.15 mL MP III,混合均勻,亦?可劇?震蕩,置冰浴中5 min。
6) 以12,000 rpm 離心5 min。
7) 小心吸出上清至另一離心管,加入2 倍體積的純酒? (或0.6 倍體積的isopropanol),混合均勻,置室溫2 min。
8) 以12,000 rpm 離心10 min。倒去上清液,沉淀以70%酒?洗二次,每次各離心1 min。
◆ 小心?要把沉淀也倒掉?!
9) 倒去上清液后,將離心管置回離心機,短暫離心后取出,以微?移液器頭盡可能吸去殘?液體。將管蓋打開,置室溫中讓沉淀干燥。待沉淀干燥后,以30 μL TE-8.0 溶解 (可以微?移液器頭反復緩慢吸放溶液,以助溶解)。
10) 加入1 μL RNase A。
11) 進?限制酶切割、電泳分析等實驗。

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