A．連接反應
1．在13m1離心管中混合下列物質：
● 20/igp8V5載體（經BstⅪ酶切和純化）
● 1．25ug插入DNA 片段（經BstⅪ、Bsi HKAI酶切和純化）
● 200ul 10×連接緩沖液
● 4ul T4 DNA連接酶
● 加水至反應總體積為2m1
2．于14℃孵育過夜。加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液和2倍體積的乙醇。 于10000r/min轉速（JA．20轉子）下離心15分鐘。除去上清，用400ul TE緩沖液將沉淀重懸。再加入1/10體積的3m01/L乙酸鈉溶液和2倍體積的乙醇， 離心后將沉淀用70％乙醇洗滌并干燥，再加入20ul TE緩沖液將連接后的DNA重懸。
B．準備電感受態細胞
1．培養E.coli MCl061 F’菌株于1L superbroth培養基直至對數生長期中期（OD600＝0．5）。
2．在冰上冷卻培養物30分鐘。于4℃、5000 r/min轉速（JA．20轉子）下離心細菌懸液15分鐘。
3．用1L冷水將細菌沉淀重懸。重復上面離心步驟，用0．5L冷水將細菌沉淀重懸。
4．重復上面離心步驟，用10ml 10％甘油將細菌沉淀重懸。于4℃6000r/min轉速下離心細菌懸液15分鐘。
5．用10％甘油重懸細菌沉淀，至終體積為2m1①。按每管200/ul分裝后先于干冰轉移到-70℃冷凍保存。
C．電轉化
1，準備4個轉化反應，其中每個電轉化杯中含有200ul細菌和5ftl連接后的DNA，于2．5kV電壓下電轉化。轉化后，立即將細菌轉移到2m1SOC培養基中，在無選擇壓的條件下于37℃培養1小時。
2．將4個轉化反應產物混合，并將取出少量產物以10倍遞減稀釋。將100ul 10-4-10-5
稀釋液涂布于LB氨芐*瓊脂培養基平板上，根據菌落生長數計算轉化的效率。剩 余的轉化反應產物加入到500m1SOPamp/glu培養基中，于37℃振搖培養直至OD600值達到0．8。
3．取100m1上述培養物，按照實驗方案6．4從庫中生成噬菌體。剩余的細胞懸液于6000r/min轉速下離心10分鐘。
4．用10m1LB培養基/15％甘油重懸細菌沉淀，將其轉移到Nunc凍存管中，每管1m1，并將其于-70℃冷凍保存，以備將來擴增庫之用。

/