（1）將單克隆抗體用包被液CBS稀釋，加入酶標(biāo)板，一般抗體包被濃度為10ug/孔，包被體積為100ul/孔，稍加晃動(dòng)使孔表面變濕，置于4℃下包被過(guò)夜（或37℃慢搖孵育2h）。第二天傾去板中包被液，每孔加入200ul/孔洗板液（PBST05），靜置5rain，甩去洗板液，于無(wú)菌干凈的濾紙上拍打，以盡量除去剩余的液體，重復(fù)洗5次，以下的洗板操作都與此相同。加入封阻液（PBSTOS-1％BSA）200ul，于37℃慢搖孵育1 h。傾去封阻液，盡量出去剩余液體，加入洗板液（PBST05），洗板5次。
（2）用封阻液（PBST05-1％BSA）稀釋噬菌體肽庫(kù)至1010TU/ml（～2X1011病毒顆粒/mi），同時(shí)加入無(wú)關(guān)鼠單克隆抗體（稀釋效價(jià)為1：100），混合后加入抗體孔中100ul/ml，37℃慢搖孵育1h；加入洗板液（PBST05），洗板5次；再加入洗板液（PBST5），洗板5次；把板倒扣在吸水紙上拍幾下，使孔中沒(méi)有液體；加入100ul/孔洗脫液，室溫慢搖孵育洗脫不超過(guò)10min（這步可采用競(jìng)爭(zhēng)洗脫法，即加入一定濃度的天然抗原，37℃,隆搖孵育60min進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫，將特異性結(jié)合在抗上的噬菌體肽競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)）。取一條新的酶標(biāo)板，預(yù)先加入
15ul、孔中和液，將洗脫液100//l加入到此酶標(biāo)板中，使其pH值變?yōu)橹行裕ㄏ疵撘侯伾傻S色轉(zhuǎn)為玫瑰紅色）。
（3）將115ul的噬菌體溶液轉(zhuǎn)入事先已放人大腸桿菌K91Kan感受態(tài)細(xì)胞的15ml試管中，室溫慢搖感染10-30min；將上述感染細(xì)胞轉(zhuǎn)入2ml含LB-0．2Tet試管中，37℃慢速震蕩（～100r/min）培養(yǎng)30-60min。取6/1l上述培養(yǎng)液作噬菌體效價(jià)的測(cè)定，并在其余的感染細(xì)胞培養(yǎng)液中加Tet母液至20ug/ml，37℃震蕩（～230r/min）培養(yǎng)過(guò)夜（這步也可以用固相擴(kuò)增的方法，即將感染的細(xì)胞培養(yǎng)液涂在3個(gè)大的LB-Tet40-Kanl00平板上，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜）。取6ul上述培養(yǎng)液作10X倍比稀釋后，分別以100ul/塊平板涂在LB-Tet40-Kanl00平板上，每個(gè)稀釋度要有重復(fù)的平板，倒置平板于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù)噬菌體菌落數(shù)，計(jì)算回收噬菌體的效價(jià)和噬菌體的獲得率。測(cè)定并紀(jì)錄每次篩選噬菌體的輸入量和輸出量，通過(guò)計(jì)算每一輪的噬菌體獲得率來(lái)檢驗(yàn)噬菌體的富集情況。次日按噬菌體擴(kuò)增和純化的方法回收和純化篩選得到的噬菌體，并測(cè)定純化噬菌體的效價(jià)，作為下一輪篩選的噬菌體溶液【用固相擴(kuò)增的方法，則將培養(yǎng)皿上的菌落用LB液體培養(yǎng)基沖洗下來(lái)轉(zhuǎn)入離心管中，37℃震蕩（270r/min）培養(yǎng)1h后，回收并純化釋放至液體中的噬菌體，其他步驟同上】。一般對(duì)同一靶分子篩選3-4次，在第二次篩選時(shí)可適當(dāng)降低包被抗體的濃度，增加篩選壓力。
（4）將zui后一次篩選洗脫下來(lái)的噬菌體中和后，取一部分噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞，用固相擴(kuò)增的方法，即將感染的細(xì)胞培養(yǎng)液涂在多個(gè)大的LB-Tet40-Kanl00平板上，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。這樣可得到噬菌體的單克隆化，便于進(jìn)一步鑒定，同時(shí)也可測(cè)定噬菌體效價(jià)。其他噬菌體不擴(kuò)增于一30℃保存?zhèn)溆谩?/a>
