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細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342 /PI 雙染

時(shí)間:2012/6/12閱讀:6586
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一、原理
1
熒光染料 Hoechst 33342 能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜,使其染上低藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng),因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342 比正常細(xì)胞的多,熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高,此外,凋亡細(xì)胞的染色體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA 結(jié)合,并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342 排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。

2PI 染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中,即活細(xì)胞對(duì)PI 染料拒染,而壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損,可被PI 染料染色。

3根據(jù)這些特性,用Hoechst 33342 結(jié)合PI 染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色,就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為:正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色(Hoechst33342++/PI+),壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++)。
二、試劑材料
Heochst 33342
染液1.0mL
Propidium Iodide
PI500 ul
10×PBS 10 mL
三、操作步驟
1.
懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞離心收集,固定培養(yǎng)的細(xì)胞消化收集后,將105~106 個(gè)細(xì)胞懸浮于1ml 培養(yǎng)基中,再加入10ul Heochst 33342 染液,混勻,370C 孵育5-15 min
2.
細(xì)胞于 40C 500 ~ 1000r/min 離心5min 棄去上清液;
3.
加入1.0ml PBS 懸浮細(xì)胞,加入5 ul PI 染液,避光混勻;
4
流式細(xì)胞儀分析或熒光顯微鏡觀察:Heochst 33342 用氪激光激發(fā)的紫外光,激發(fā)波長(zhǎng)為352nm,發(fā)射波長(zhǎng)為400 ~ 500nm,產(chǎn)生藍(lán)色熒光;PI 用氬離子激光激發(fā)熒光,激發(fā)光波波長(zhǎng)為488nm,發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm,產(chǎn)生紅色熒光。分析藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。結(jié)果判斷:在藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上,結(jié)果為:正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光,凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光,壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。
四、注意事項(xiàng)
1.
在紅色熒光對(duì)藍(lán)色熒光散點(diǎn)圖上,還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡,可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。
2.
Heochst 33342 染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過長(zhǎng),一般控制在20min 之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起Heochst33342 的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移,導(dǎo)致紅色熒光與藍(lán)色熒光的比例改變,從而影響結(jié)果的判斷。
3.Propidium Iodide
PI)有毒,操作時(shí)要戴手套。

 

 

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