熒光素標(biāo)記TRIM32抗體IgG，Anti-TRIM32/FITC

細(xì)胞的處理方法：向收集到的細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，終濃度為2ug/ml）在冰上裂解30—60min，然后再插入冰盒進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。（超聲強(qiáng)度不能過(guò)大，防止蛋白碳化）
組織的處理方法：按實(shí)驗(yàn)要求將組織從動(dòng)物體內(nèi)取出（樣品不宜反復(fù)凍融），取少量（1-2g左右）放入玻璃勻槳器中研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入EP管中進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次5-7秒，重復(fù)5-6次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用

顯色反應(yīng)（重組蛋白一般用AP顯色或是DAB顯色，裂解液一般用發(fā)光法）
① HRP標(biāo)記二抗用DAB顯色，按順序依次將DAB三種劑各取3滴于5ml蒸餾水中，避光混勻，將膜加入顯色液中避光顯色5-15min終止反應(yīng)，對(duì)照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存
②        AKP標(biāo)記二抗用AP顯色，在10mlAKP緩沖液中加入66µlNBT溶液和33µl BCIP溶液混勻，室溫下將膜放入顯色（37℃可加速反應(yīng)）5-15min。對(duì)照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存。
③底物發(fā)光法：將兩種顯色底物1：1等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來(lái)，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時(shí)間根據(jù)光的亮度來(lái)衡量），顯影、定影。（熒光在一段時(shí)間后會(huì)越來(lái)越弱要控制好時(shí)間）