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熒光素標記辣椒素受體抗體IgG相關知識

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熒光素標記辣椒素受體抗體IgG相關知識

熒光抗體稀釋法 
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價,若二者效價相差較大,則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度,使特異性染色呈陽性,而使非特異性染色保持陰性,稀釋方法和染色效價測定方法相同。

純化抗原法 
用各種方法提純單一成分的抗原是產生單價特異性抗體的zui主要條件。近代免疫化學技術(免疫吸收法)和柱層析法等提供了很大的可能性,可參考有關專著。 

DEAE纖維素柱層析法 
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下: DEAE-纖維素柱的裝柱,洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換2050mg標記蛋白量為宜 

葡聚糖凝膠G-50柱層析法 
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法,詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體1518ml(按床體積的5%10%加樣),使其緩慢滲入柱內,待即將全部入柱時,加入PBS少許,關閉下口,停留3040min ,使游離熒光充分進入細篩孔中,然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后,熒光抗體即向下移行,逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線,隨著大量洗脫液的不斷加入,二者分離距離越來越大,熒光抗體zui先流出,分前、中、后三部分收集,測F/P比值,合格者合并,濃縮,分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白(發生沉淀反應),繼續洗脫,游離熒光素則相繼被洗脫下來,至洗脫液中無蛋白和熒光素后,此層析柱即可再用。 
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類,可先在過柱前透析一夜,否則,NH4+太濃,在蛋白未*洗脫時即出現NH4+,因而影響提純與回收蛋白,一般待洗脫液出現蛋白時,即進行收集,之后出現SO4++(用1%BaCl2檢查發生白色沉淀)。zui后是NH4+,(用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀),待洗脫液無SO4++NH4+后可再用。 
如僅用小量熒光抗體,可用1×20cm的柱層析柱,取2g Sephadex G-50裝柱,即可過濾23.5ml熒光抗體。

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