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上海科興商貿(mào)有限公司

ELISA技術(shù)測定

時間:2014-5-19閱讀:316
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ELISA技術(shù)測定

一、儀器、原料和試劑

儀器

聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。

原料

單克隆抗體

試劑

1. 抗原及酶標記抗體

①抗原:兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG,Code No.A0423);

②酶標抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP,Code No.P0260);均為

DAKO 公司產(chǎn)品,使用時按照說明書要求稀釋。

4. 洗滌液(含0.05%Tween 20的PBS):1LPBS 中加入Tween-20 500μL。

5. 封閉液(含1%牛血清白蛋白,0.1%Tween 20的PBS):10mLPBS 中加入100mgBSA,10μLTween-20。

6. 底物溶液

①*緩沖液(0.1mol/LpH6.0):稱Na2HPO4·12H2O2.2g,NaH2PO4·2H2O 6.84g,用蒸餾水溶解,定容至500mL。

② TMB 貯液:稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中,4℃避光保存。

③底物應用液:現(xiàn)用現(xiàn)配,磷酸鈉緩沖液10mL,TNB 貯液10μL。30%H2O2 15μL,混勻。

7. 終止液:2mol/LH2SO4

二、操作步驟

①抗原包被:兔抗人IgG 作為抗原,用包被液l:8000稀釋,100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板

中。4℃放置過夜。

②洗滌:次日傾去凹孔內(nèi)的液體,洗滌液洗3次。

③封閉:加l00μL/孔封閉液,室溫放置0.5h。

④洗滌:用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品(一抗):將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另—塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1:2或1:10),100μL /孔加到已包被的板上,每個樣品平行做兩份,PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對照,已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h。

⑥洗滌:用洗滌液洗3次。

⑦加酶標抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP,用封閉液l :8000稀釋,100μL/孔,加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

⑧洗滌:用洗滌液洗5次,蒸餾水洗2次。

⑨顯色:加新鮮配制的底物溶液100μL/孔,室溫暗處放置5~30min,顯示藍色。

⑩終止反應、比色:加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標儀測定450nm 處各孔的吸光值,陽性反應的zui大稀釋度為待測樣品的效價。

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