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蘇州艾瑞德生物科技有限公司
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硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經被廣泛應用，作為禽類、水產和豬促生長的添加劑。呋喃它酮在1995年被禁用。由于硝基呋喃類藥物在體內很快就能被代謝，而在組織中結合的代謝產物則能存留較長的一段時間，所以管理部門就以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。
【產品簡介】
硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經被廣泛應用，作為禽類、水產和豬促生長的添加劑。呋喃它酮在1995年被禁用。由于硝基呋喃類藥物在體內很快就能被代謝，而在組織中結合的代謝產物則能存留較長的一段時間，所以管理部門就以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。
呋喃它酮代謝物快速檢測試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點，適用于動物組織（水產、雞、豬、牛）、牛奶等大批量樣品中的呋喃它酮代謝物快速檢測。
【測定原理】
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產和雞肉等組織樣本中的AMOZ，在微孔條上預包被上偶聯抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的原理來進行的，樣本中的AMOZ和微孔條上預包被偶聯抗原競爭抗呋喃它酮代謝物的衍生物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的AMOZ含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出呋喃它酮代謝物含量。
【試劑盒技術指標】
規 格：96孔/盒
靈 敏 度： 0.05ppb
檢測時間： 75min
樣本檢測下限：
組織、肝臟………………………………0.1ppb
蜂蜜、牛奶、腸衣………………………0.1ppb
魚/蝦等水產品組織因存在一定的干擾，檢測下限為0.15ppb
交叉反應率：
呋喃它酮代謝物……………………………… *
*代謝物………………………………﹤0.1%
*代謝物………………………………﹤0.1%
*代謝物………………………………﹤0.1%
回收率：
組織、肝臟………………………………90%±15%
蜂蜜、牛奶、腸衣………………………80%±15%
【試劑盒組成】
1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
2、 標準液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
3、 酶標記物 7ml………………… 紅色帽
4、 抗體工作液 7ml………………… 藍色帽
5、 底物A液 7 ml………………… 白色帽
6、 底物B液 7 ml ………………… 黑色帽
7、 終止液 7 ml ………………… 黃色帽
8、 20X濃縮洗滌液40 ml…………… 白色帽
9、 2X濃縮復溶液 50 ml …………… 透明帽
10、 衍生化試劑 10ml ………………白色帽
【所用儀器、試劑】
具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl
試 劑：氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、濃HCl、*、ZnSO4•7H2O、亞硝基鐵******（K2Fe（CN）5•NO•3H2O）
【樣本前處理步驟】
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚、蝦等。
（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
樣本前處理需配制：
配液1、用去離子水將2×濃縮復溶按1：1稀釋（1份濃縮復溶液+1份去離子水），用于提取后的樣本復溶。
配液2、C液：稱10.7g亞硝基鐵******用去離子水定容至100ml。
配液3、D液：稱28.8g 硫酸鋅用去離子水溶解定容至100ml。
配液4、 0.1MK2HPO4 稱11.4g K2HPO4•3H2O加去離子水溶解定容至500ml。
配液5、 1M HCl 溶液
取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。
配液6、1M NaOH溶液
取4g NaOH加去離子水定容至100ml。
樣本的處理方法：
（a） 奶樣
1、 取出5ml的奶樣本到玻璃離心管中,分別加入C液和D液各250µl。
2、 用振蕩器充分混合樣本,用恒溫離心機4000r/min，2-10℃離心10min.若沒有恒溫離心機,則先將樣本降溫至大約8℃,然后離心。
3、 接（b）的描述方法
（b） 組織、蜂蜜、腸衣、肝臟
1、 取1±0.05g的均質樣本（組織、蜂蜜、腸衣、肝臟），牛奶的離心上清液1.1ml（相當1ml奶樣），分別加入4ml的去離子水，0.5ml1M HCl和100µl衍生化試劑，充分振蕩。
2、 在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育（2h）；
3、 分別加入5ml 0.1M K2HPO4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充分振蕩5min；
4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。
5、 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于50℃氮氣/空氣吹干。
6、 用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀釋好的復溶液充分混合30s；在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。
7、 取50µl下層相用于分析。
樣本稀釋倍數：2
（c）特殊樣本（油炸熟食、非油炸熟肉）的處理方法
1、取1±0.05g的均質樣本于50ml離心管中，加入4.5ml甲醇和0.5ml去離子水，震蕩2min,
4000r/min離心5min，傾倒出全部液體，再加入5 ml乙腈和5ml 正己烷，震蕩2min,4000r/min離心5min傾倒出全部液體。
2、 在處理后的樣本離心管中加入4ml的去離子水，0.5ml1M HCl和100µl衍生化試劑，充分振蕩。
3、 接（b）第2步描述方法
【酶標免疫分析程序】
1、 使用前將試劑盒置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出需要數量的酶標板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于2-8℃不要冷凍。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做2孔平行。
5、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl /孔的抗體，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃環境中反應60min。
6、 倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。加入250µl/孔洗滌液，15-30s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。
7、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加入底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環境避光顯色15min。
8、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測），測定每孔吸光度值（OD值）。
【結果判定】
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與AMOZ的含量成負相關。
1、粗略判定：
用樣品的平均吸光度值與標準值比較即可得出樣本所含AMOZ濃度范圍（ng/ml）。假設樣品1的吸光度值為0.238，樣品2的吸光度值為1.130，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.721；0.05ppb為1.454；0.15ppb為1.153； 0.45ppb為0.667； 1.35ppb為0.295； 4.05ppb為0.106。則樣品1的濃度范圍1.35ppb-4.05ppb；樣品2的濃度范圍0.15ppb-0.45ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中AMOZ實際濃度。
2、定量判定：
所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以*，即百分吸光度值。
以標準品百分吸光率為縱坐標，以AMOZ標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中AMOZ實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。
3、標準曲線：
B/B0 （%）
0.05 0.15 0.45 1.35 4.05
AMOZ（ppb） [µg/kg]
圖1： 呋喃它酮代謝物檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現性：
%CV
AMOZ（ppb） [µg/kg]
圖2：呋喃它酮代謝物檢測試劑盒的精密度
由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出呋喃它酮代謝物檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應呋喃它酮濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。
【注意事項】
1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒*反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
【儲存】
原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝
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