所用的方法稱為間接法，也是目前zui常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。
    此法是測定抗體zui常用的方法,屬非競爭結合試驗。其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結合成固相抗原-受檢抗體復合物，再用酶標二抗（針對受檢抗體的抗體，如羊抗人IgG抗體）與固相免疫復合物中的抗體結合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標二抗復合物，測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。
    間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測抗體之標本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標記抗抗體，（對人的標本來說即加酶標抗人球蛋白IgG、IgM），再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結果可用目測或用分光光度計定量測定，本法用不同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學診斷。如用酶標記抗人IgM,則可用于早期診斷。
操作步驟：
　　（1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。# @* F# f6 Y1 s& K） i# P
　　（2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
　　（3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。- @7 m+ J  C2 j1 L; W" r
　　（4）加底物顯色
間接法由于采用的酶標二抗是針對一類免疫球蛋白分子（如抗人IgG）,因此該法只需要換固相抗原，即可用一種酶標二抗檢測各種與抗原相應的抗體，具有更廣泛的通用性。（ ]# L6 ~0 K& z- \\6 a% M
　　本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
　　間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
　　間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。