金擔子素A（AbA）

金擔子素A（AbA）

金擔子素A（Aureobasidin A，AbA）是從絲狀真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分離出來的環酯肽類抗生素，具有很強的抗真菌能力。在較低的濃度下（0.1-0.5 μg/ml）即可對酵母產生毒性。對其敏感的真菌種類包括：出牙酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）和黑曲霉（A. niger.）。作用機制在于AbA抑制了真菌生長所依賴的肌醇磷酰胺（inositol phosphorylceramide，IPC）合成酶的活性，干擾鞘脂合成，從而進一步殺死菌株。編碼IPC合成酶的基因研究較多的有來自釀酒酵母菌的AUR1 基因，以及構巢曲霉的AURA基因，兩者具有同源性。通過對這些編碼基因進行突變即可使得菌株對AbA產生抗性，如AUR1-C基因。

AbA非常適合用作陽性克隆子篩選用的藥物選擇性標記。AbA抗性也是酵母單/雙雜交研究中理想的報告子。本品為溶于甲醇的AbA溶液，濃度為1 mg/ml。具體的工作濃度取決于宿主細胞的敏感度（見表1. AbA對各種酵母菌的低抑菌濃度（MIC））。

操作步驟（抗AbA的酵母轉化系統）
1）加入0.5 ml過夜培養的酵母到50 ml YPD培養基中（配方：1L液體培養基含有10g yeast extract，20g polypeptone， 20g D-glucose；固體培養基另外加入2%瓊脂；）。
2）30℃培養約6小時，測定OD660為1～2。使用二倍體時，測定OD660為2～4。
3）1,000×g離心5分鐘。
4）用10 ml Solution A（配方：100 mM Lithium acetate，10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA）懸浮沉淀，1,000×g離心5分鐘。
5）用Solution A重懸沉淀，直到OD660為150。
6）在管內分取100 µl細胞懸浮液，30℃培養1小時。
7）加入5 μg載體（環狀或線性DNA）和150 μg Carrier DNA（已經過100℃加熱10分鐘，并迅速冷卻）。
【注】：pAUR101需使用線性DNA進行轉化。使用環狀DNA會降低轉化效率甚至轉化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的質粒DNA進行轉化。
8）加入850 µl Solution B（配方：取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 ml Solution A充分溶解，需要現用現配），輕輕混勻。
9）30℃培養30分鐘后，42℃培養15分鐘。
10）室溫放置10分鐘。
11）5,000 rpm離心1分鐘，用5 ml YPD培養基懸浮沉淀。
12）30℃培養6小時~過夜。
13）5,000~10,000 rpm離心，用1-10 ml 0.9% NaCl懸浮沉淀。
14）在YPD選擇培養基平板（含有一定濃度的AbA，依菌株類型而定）上接種100 µl細胞懸液。30℃培養3-4天后轉化完成。
15）挑取陽性轉化子，和/或測定轉化效率（以每微克質粒DNA轉化的菌落數來表示）。

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