反應效率視為實時熒光定量PCR 分析設計和優化的關鍵因素。利用標準曲線(通過對目標模板進行連續梯度稀釋獲得) 獲取效率值。該效率值可作為總反應的“健康”標志。低效率與高效率所造成的影響有所不同。改善上述兩種情形的步驟則相差甚遠。理想的反應效率為100%，但反應效率在90–110% 范圍內都是可以接受的。
確定某個特定的分析效率是否低下的方法是稀釋模板生成標準曲線(模板稀釋的范圍應涵蓋所有未知樣本)，然后查看該范圍內的效率。它應盡可能接近100%。熔解曲線出現多個峰或凝膠顯示多種產物意味著反應源物質之間存在競爭作用，這必將對反應效率產生影響。一旦確定反應被抑制或效率較低，則可采取一些步驟將效率值重新調整到理想范圍內。
1、對于抑制作用，可去除模板濃度zui高的反應孔并重新分析標準曲線。如果效率重新回到110% 以下，則分析良好。
2、另一種解決方案是重新純化模板。切記應延長干燥時間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。
3、通過分析優化可解決效率低下的問題。此過程有時相對簡單，但在某些情況下，隨著分析復雜度的提高，優化過程可能十分耗時費力。
4、擴增單個產物時，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應效率，但當出現競爭作用時，則應降低鎂的濃度。
5、在某些情況下(主要是多重反應中)，必須采用引物和探針優化基質。此時，需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度，有時甚至還需檢測探針比值，以找出分析的理想濃度組合。引物濃度介于100至600nM之間，而探針濃度則在100nM至400nM 之間。
6、根據引物的Tm 值，確保熱循環條件(尤其是退火溫度)適當，且引物設計時使之有相似的Tm 值。
