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技術(shù)文章

單克隆抗體的制備

閱讀:969發(fā)布時間:2012-4-10

概述

  B淋巴細胞在抗原的刺激下,能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細胞的這種能力和量是有限的,不可能持續(xù)分化增殖下去,因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞,再進一步克隆化,這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤細胞的無限分裂的能力,又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細胞的能力。將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養(yǎng)或注入小鼠腹水內(nèi)即可獲得大量的、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。

過程

  1)免疫脾細胞的制備 制備單克隆抗體的動物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方法同一般血清的制備,也可采用脾內(nèi)直接免疫法。

 

  2)骨髓瘤細胞的培養(yǎng)與篩選 在融合前,骨髓瘤細胞應(yīng)經(jīng)過含8-AG的培養(yǎng)基篩選,防止細胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT的活性(恢復(fù)HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養(yǎng)基中存活)。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),融合前24h換液一次,使骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期。

 

  3)細胞融合的關(guān)鍵:

 

  1技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如,供者淋巴細胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。

 

  2融合試驗zui大的失敗原因是污染,融合成功的關(guān)鍵是提供一個干凈的環(huán)境,以及適宜的無菌操作技術(shù)。

 

  4)陽性克隆的篩選 應(yīng)盡早進行。通常在融合后10天作*次檢測,過早容易出現(xiàn)假陽性。檢測方法應(yīng)靈敏、準確、而且簡便快速。具體應(yīng)用的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì),以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法zui簡便,RIA法zui準確。陽性克隆的篩選應(yīng)進行多次,均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。

 

  5)克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體。克隆化應(yīng)盡早進行并反復(fù)篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩(wěn)定的,有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細胞株。

 

  動物免疫

 

  細胞融合

 

  克隆篩選

 

  交雜瘤細胞的克隆化

 

  腹水制備與單抗純化

 

  關(guān)于抗體制備的詳細內(nèi)容參見“中國免疫學(xué)實驗網(wǎng)”。


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