人巨細(xì)胞病毒 （HCMV）核酸擴(kuò)增檢測試劑盒說明書
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【名稱】
通 用 名：人巨細(xì)胞病毒 （HCMV）核酸擴(kuò)增檢測試劑盒說明書
英 文 名：Human Cytomegalovirus Fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction （PCR）Diagnostic kit
漢語拼音：ren ju xi bao bing du （HCMV）he suan kuo zeng jian ce shi ji he
【目的】本試劑盒適用于檢測血液（全血或血清）、尿液、乳汁等樣本中人巨細(xì)胞病毒 （HCMV）DNA，用于人巨細(xì)胞病毒 （HCMV）感染的輔助診斷及其感染病人藥物治療的療效監(jiān)控。其檢測結(jié)果僅供臨床參考。
【原理】本試劑盒選取一對人巨細(xì)胞病毒（HCMV）特異性引物和一條特異性熒光探針，應(yīng)用堿裂解法提取DNA，后者在耐熱DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer（內(nèi)含Mg2+、Tris-HCl等）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過PCR-熒光探針體外擴(kuò)增法對人巨細(xì)胞病毒（HCMV）一段高保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，從而達(dá)到快速實時定量檢測之目的。
【組成】
名 稱 | 數(shù)量 | 規(guī)格 |
核酸提取液A | 2管 | 2000μl/管 |
核酸提取液B | 4管 | 500μl/管 |
Taq 酶系 | 1管 | 80μl/管 |
HCMV–PCR MIX | 1管 | 960μl/管 |
HCMV陽性質(zhì)控品 | 1管 | 50μl/管（1×10P7PCopies/ml） |
陰性質(zhì)控品 | 1管 | 500μl/管 |
備注：10×RCLB等另行配備。
【標(biāo)本采集】
1. 適用標(biāo)本：血液（全血或血清）、尿液、乳汁等。
2. 標(biāo)本采集：
血清：*抽取待檢者靜脈血2ml，置于干燥管中，充分混勻，密閉送檢。
全血：*抽取待檢者靜脈血2ml，置于*抗凝管中，充分混勻，密閉送檢。
尿液：取晨尿10-50ml置于無菌50ml離心管中，3,000g離心5min，棄上清，沉淀加1ml生理鹽水，混勻后轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml離心管中，密閉送檢。
乳汁：取乳汁5-10ml置于無菌玻璃管中，密閉送檢。
【適用儀器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500、ABI PRISM 7300、LightCycler等毛細(xì)管的儀器，MJ Opticon系列或取得資格認(rèn)證的定量PCR儀。
【保存和運(yùn)輸】 標(biāo)本可立即用于測試，也可保存于-20℃待測，保存期為6個月。
【使用方法】
1． DNA提取
1.1全血：按下述步驟操作，用戶也可用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。
1.1.1將抗凝血搖勻，取500μl轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml 離心管中，編號標(biāo)記。
1.1.2 加入1ml 1×紅細(xì)胞裂解液（RCLB,試劑盒配備10×RCLB，使用前請用雙蒸餾水按1：9比例配制成1×RCLB），劇烈震蕩30s，3000g離心5min，棄上清。
1.1.3 重復(fù) 1.1.2 兩至三次至無明顯紅色沉淀。（若沉淀明顯，請再重復(fù)步驟1.1.2 一次）。
1.1.4 加入1ml生理鹽水，劇烈震蕩15s，13,000g離心1min，棄上清。
1.2 血清、尿液、乳汁：處理前請充分混勻，取標(biāo)本100μl，加入100μl等量核酸提取液A，充分混勻，13,000rpm離心3分鐘，棄上清（勿碰及下面沉淀），沉淀加50μl核酸提取液B，100℃處理10分鐘，13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。
陰性質(zhì)控品：取50μl陰性質(zhì)控品，加50μl核酸提取液B充分混勻（提取液用前需室溫溶解并充分混勻）后100℃10分鐘，13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。
HCMV陽性質(zhì)控品：直接取4μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或按照PCR擴(kuò)增介紹方法進(jìn)行定量分析。
2．PCR擴(kuò)增
從試劑盒中取出HCMV-PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | HCMV-PCR MIX | Taq酶系 |
用量 | 24μl | 2μl |
計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入26μl，向每管中加入處理后樣品或HCMV-陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品（使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml）和陰性質(zhì)控品4μl，10,000rpm瞬時離心30秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品，陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置反應(yīng)體積（30μl）、樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)種類（報告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為TAMRA）和循環(huán)條件:
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 （需要剪掉反應(yīng)蓋），ABI PRISM7300/7500（使用8聯(lián)管），MJ Opticon（使用8聯(lián)管）等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件：94℃→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40個循環(huán)。
LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件：94℃→2分鐘，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40個循環(huán)。
3．結(jié)果分析判定
反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到*（correlation數(shù)值介于-0.97~-1之間，correlation數(shù)值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的未知標(biāo)本數(shù)值（Qty-Copies/ml）。
【質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)】
陰性質(zhì)控品：全部陰性。沒有熒光值增長。
HCMV-陽性質(zhì)控品：陽性質(zhì)控品的 Ct 值均應(yīng)小于 35.0。
∣r∣≥0.97（correlation數(shù)值介于-0.97~-1之間，correlation數(shù)值等同于∣r∣值）。
以上條件應(yīng)同時滿足 ，否則，此次試驗視為無效，全部試驗應(yīng)重新進(jìn)行。
【結(jié)果判定】
測定結(jié)果的計算：
如果Ct值﹤38，則實驗樣品的HCMV- DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）= Qty-Copies/ml；
如果38﹤Ct值﹤40,為灰區(qū)建議重新檢測，重新檢測若38﹤Ct值﹤40判為陽性，否則為陰性。
如果Ct值=40，則HCMV-DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）﹤1×10P2PCopies/ml （低于檢測下限）。
【注意事項】
使用前請仔細(xì)閱讀說明書。并且嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。
試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)充分融化混勻并經(jīng)高速短暫離心后試用。每盒試劑請于3 次內(nèi)使用完畢。
試劑盒須避光保存，以免熒光物質(zhì)衰減。所有使用的離心管、 Tip 頭應(yīng)高壓滅菌，而且必須不含 DNase。
PCR操作應(yīng)嚴(yán)格按照要求分區(qū)（試劑配制區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)等），防止實驗室污染。
試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【公司名稱】 廣州健侖生物科技有限公司
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