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ImageStream 技術(shù)建立在傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)基礎(chǔ)之上，結(jié)合了熒光顯微成像技術(shù)，它具有多個(gè)檢測(cè)通道，可以對(duì)通過流動(dòng)室中的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行多參數(shù)量化分析，獲得全新的細(xì)胞形態(tài)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。

ImageStream 技術(shù)與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀很類似，其系統(tǒng)平臺(tái)也是由液流系統(tǒng)，光學(xué)系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)三大部分組成。液流系統(tǒng)通過注射泵將樣本細(xì)胞懸液和鞘液注入流動(dòng)室中，細(xì)胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個(gè)流過檢測(cè)窗口。光學(xué)系統(tǒng)中光源照射通過檢測(cè)窗口的細(xì)胞，從而產(chǎn)生光信號(hào)。光源分為兩種，其一用于產(chǎn)生明場(chǎng)細(xì)胞圖像，另一種是用于產(chǎn)生熒光細(xì)胞圖像的激光器。定制的全固態(tài)激光器，功率高且可調(diào)節(jié)，有利于同時(shí)檢測(cè)多種熒光信號(hào)或是微弱信號(hào)。 另外的 785 nm 激光器，用于檢測(cè)側(cè)向角（SSC）參數(shù)，極大提高了該參數(shù)的檢測(cè)靈敏度。光源照射細(xì)胞產(chǎn)生的光信號(hào)被大數(shù)值孔徑的物鏡收集，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到由二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧。光信號(hào)在這里被分成不同波段投射到 CCD 的相應(yīng)檢測(cè)通道上，產(chǎn)生明場(chǎng)細(xì)胞圖像、暗場(chǎng)細(xì)胞圖像和多個(gè)熒光通道的細(xì)胞圖像，即每個(gè)細(xì)胞可以獲取 12 副不同成像。ImageStream 技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)十分，采用不是傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的 PMT 檢測(cè)方式，而是基于時(shí)間延遲積分技術(shù)的 CCD（TDI (time delay integration) CCD）采集，保證了系統(tǒng)對(duì)高速運(yùn)動(dòng)的流體細(xì)胞也能采集高質(zhì)量圖像。

ImageStream 系統(tǒng)配有功能強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析軟件 IDEAS，可以對(duì)每個(gè)細(xì)胞分析超過 500 種量化參數(shù)。這些參數(shù)不僅包括細(xì)胞整體的散射光和熒光信號(hào)強(qiáng)度，還包括對(duì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞信號(hào)分布的分析。

從 2005 年開始，Amnis 量化成像流式分析儀被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物研發(fā)、血液、免疫、微生物、海洋、腫瘤、寄生蟲、干細(xì)胞、毒理、病毒等各個(gè)領(lǐng)域。隨著 ImageStream 高速顯微成像流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展成熟，越來越多的科研人員開始將這種革命性的技術(shù)手段運(yùn)用到自身的研究領(lǐng)域，并發(fā)表了大量有影響力的論文。

Amnis 量化成像流式細(xì)胞儀的常見應(yīng)用

▎ 細(xì)胞周期

生命是從一代向下一代傳遞的連續(xù)過程，因此是一個(gè)不斷更新、不斷從頭開始的過程。細(xì)胞的生命開始于產(chǎn)生它的母細(xì)胞的分裂，結(jié)束于它的子細(xì)胞的形成。通常將子細(xì)胞形成作為一次細(xì)胞分裂結(jié)束的標(biāo)志。細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。在這一過程中，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。

Imagestream 成像流式細(xì)胞儀對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像，不僅可以根據(jù) G0/G1 期、S 期和 G2/M 期 DNA 含量的不同進(jìn)行區(qū)分，還可以根據(jù) M 期細(xì)胞核形態(tài)的不同將 M 期中前期、中期、后期和末期細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，因此可以計(jì)算出細(xì)胞周期中 G0/G1 期、S 期、G2/M 期及 M 期中前期、中期、后期和末期細(xì)胞的比例。這大大提高了流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期的分析能力。

圖 1. 傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的細(xì)胞周期分布圖

圖 2. 成像流式細(xì)胞儀可以根據(jù) M 期細(xì)胞的前期、中期、后期和末期的形態(tài)不同對(duì)細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分并計(jì)算其比例

▎細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡（apoptosis）指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。細(xì)胞凋亡首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA 降解成為約 180bp-200bp 片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，無(wú)內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。細(xì)胞凋亡的指標(biāo)有多種，可以判斷凋亡的不同時(shí)期。從早期凋亡的細(xì)胞膜磷脂酰外翻，到中期凋亡的 Caspase 活化、的釋放、線粒體膜電位的喪失等，到晚期凋亡的核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核 DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在 180-200 bp 的 DNA 片段。在成像流式細(xì)胞儀上，只要使用 PI 染色即可以區(qū)分活細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。這是因?yàn)樵诨罴?xì)胞中 PI 染色為陰性，壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞 PI 染色為陽(yáng)性，但壞死細(xì)胞的細(xì)胞核保持完整形態(tài)，而凋亡細(xì)胞發(fā)生了 DNA 的凝集，因此可以根據(jù)細(xì)胞核形態(tài)的不同對(duì)壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和統(tǒng)計(jì)。

圖 3. 成像流式細(xì)胞儀根據(jù) PI 染色即可區(qū)分活細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。

▎細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

細(xì)胞活性、分化及宿主防御功能受到多種過程調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)過程是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。IDEAS®軟件利用形態(tài)學(xué)量化參數(shù) Similarity，通過對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞核的圖像進(jìn)行自動(dòng)分析處理，精確量化細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的核轉(zhuǎn)運(yùn)程度。例如核因子 NF-кB 信號(hào)通路主要涉及機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和調(diào)亡以及腫瘤生長(zhǎng)抑制過程的信息傳遞。在多數(shù)細(xì)胞類型，NF-кB 在胞漿與抑制性蛋白質(zhì)結(jié)合形成無(wú)活性的復(fù)合物。當(dāng)腫瘤壞死因子等作用于相應(yīng)受體后，可通過第二信使激活此系統(tǒng)。激活過程是通過磷酸化抑制性蛋白使其構(gòu)象改變而從 NF-кB 脫落，使得 NF-кB 得以活化。活化的 NF-кB 進(jìn)入細(xì)胞核，與 DNA 接觸，并啟動(dòng)或抑制有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。因此未活化的 NF-кB 位于細(xì)胞質(zhì)，而活化后的 NF-кB 位于細(xì)胞核。傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀只能檢測(cè)細(xì)胞整體熒光強(qiáng)度，而無(wú)法區(qū)分位于細(xì)胞不同部位的熒光的細(xì)胞。成像流式根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的圖像判斷該細(xì)胞是否發(fā)生 NF-кB 信號(hào)通路的活化。

實(shí)驗(yàn)案例：

NF-кB 在全血不同白細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)

圖 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂多糖能夠特異性地誘導(dǎo) CD14 陽(yáng)性單個(gè)核細(xì)胞中的 NF-кB 核轉(zhuǎn)位（直方圖藍(lán)色部分），而并不誘導(dǎo) CD3 陽(yáng)性單個(gè)核細(xì)胞的 NF-кB 核轉(zhuǎn)位（直方圖黑色部分）

▎納米藥物研究

納米藥物具有許多傳統(tǒng)藥物所不具備的優(yōu)勢(shì)，如顯著提升藥物的作用效果和靶向性，在改善治療效果的同時(shí)降低藥物毒副作用對(duì)機(jī)體的影響；調(diào)節(jié)釋藥速度，改變藥物在體內(nèi)的分布；提高藥物溶解度和生物利用度等。納米藥物的研究已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展和藥物創(chuàng)新的重要方向，在預(yù)防與控制癌癥等重大疾病研究領(lǐng)域都有望取得重要突破，極有可能在不遠(yuǎn)的將來釋放巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

納米藥物雖然是具有巨大發(fā)展前景的新型藥物，但納米藥物在臨床應(yīng)用中的生物機(jī)制，以及納米藥物作用的細(xì)胞模型都非常欠缺，亟需發(fā)展。納米毒理學(xué)，納米藥物動(dòng)力學(xué)，納米藥物結(jié)構(gòu)優(yōu)化和功能測(cè)定都亟需具備高通量和高內(nèi)涵性能的新型細(xì)胞學(xué)水平研究工具。量化成像分析流式細(xì)胞儀以其高通量的數(shù)據(jù)獲取能力和量化成像分析能力很好地滿足了納米藥物的研究需求，為許多已經(jīng)發(fā)表重要的高水平工作提供了關(guān)鍵性的數(shù)據(jù)，引起業(yè)內(nèi)同行的高度重視。

量化成像流式細(xì)胞儀對(duì)納米材料的研究主要有兩種方式。一種是通過衡量納米藥物在細(xì)胞內(nèi)部的熒光來判斷納米藥物在細(xì)胞內(nèi)的攝入程度，即內(nèi)化值，內(nèi)化值越大，表示細(xì)胞內(nèi)部攝入的納米藥物越多；第二種是通過計(jì)算細(xì)胞內(nèi)部所攝入的納米藥物熒光點(diǎn)的數(shù)目來衡量納米藥物的攝入程度。

圖 5. 分析納米顆粒是否進(jìn)入細(xì)胞的兩種方法，一是通過內(nèi)化參數(shù) Internalization 來實(shí)現(xiàn)的，它代表的是外源信號(hào)在細(xì)胞以內(nèi)存在的情況。該參數(shù)能夠在單個(gè)細(xì)胞以及整個(gè)細(xì)胞群體水平衡量納米載體或納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的程度。二是統(tǒng)計(jì)細(xì)胞內(nèi)的納米顆粒數(shù)量，是通過計(jì)點(diǎn)參數(shù)，即 Spot Count Feature 來完成。能夠統(tǒng)計(jì)在每個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)，有多少個(gè)納米顆粒形成的小點(diǎn)，能反映納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的效率。

▎細(xì)胞治療

近年來腫瘤的取得了巨大的進(jìn)步，尤其是嵌合體抗原受體修飾 T 細(xì)胞 (Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T) 技術(shù)在治療白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤，取得了較大的成果。CAR-T 技術(shù)治療腫瘤的步驟包括提取患者 T 細(xì)胞，進(jìn)行體外基因轉(zhuǎn)染操作將腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體表達(dá)于 T 細(xì)胞膜表面，在體外擴(kuò)增 CAR-T 細(xì)胞，并回輸 CAR-T 細(xì)胞到患者體內(nèi)對(duì)腫瘤進(jìn)行殺傷。來自耶魯大學(xué)的 Patrick 等科學(xué)家則將這一技術(shù)更加推動(dòng)一步，十分巧妙的設(shè)計(jì)和合成了模擬抗體類似特性的化合物 SyAM-P，該化合物一端可以結(jié)合到前列腺癌細(xì)胞表面抗原 PSMA，一端結(jié)合免疫細(xì)胞表面 FcγRI，通過這種方式可以使免疫細(xì)胞靶向殺傷前列腺癌細(xì)胞，如圖 6 所示。

圖 6. 抗體特性模擬化合物

當(dāng) SyAM-P 引導(dǎo)單核細(xì)胞靶向前列腺癌細(xì)胞后，單核細(xì)胞通過吞噬效應(yīng)進(jìn)行前列腺癌細(xì)胞的殺傷。與傳統(tǒng)流式不同的是，Amnis 可以結(jié)合圖像清晰的觀察到效應(yīng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬過程，如圖 7 所示。其中 Target 為綠色熒光標(biāo)記的前列腺癌細(xì)胞，Effector 為紅色熒光標(biāo)記的單核細(xì)胞，圖 7 上方是單核細(xì)胞已經(jīng)完成對(duì)前列腺癌細(xì)胞吞噬后的細(xì)胞圖像，可見綠色的前列腺癌細(xì)胞位于單核細(xì)胞內(nèi)部，而圖 7 下方則是單核細(xì)胞正在進(jìn)行吞噬過程的細(xì)胞圖像，可見單核細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞之間吞噬杯的形成。