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天長市華玻實驗儀器廠
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【詳細說明】蛋白質的定量測定(一)--凱氏定氮法目的要求(1)學習微量凱氏定氮法的原理
【詳細說明】
蛋白質的定量測定(一)-- 凱氏定氮法
目的要求
(1)學習微量凱氏定氮法的原理。
(2)掌握微量凱氏定氮法的操作方法。
實驗原理
生物材料的含氮量測定在生物化學研究中具有一定的意義，如蛋白質的含氮量約為16％，測出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測定，通常采用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由于具有測定準確度高，可測定各種不同形態樣品等兩大優點，因而被為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質含量的標準分析方法。其原理如下：
1. 消化：有機物與濃硫酸供熱，使有機氮全部轉化為無機氮——硫酸銨。為加快反應，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點。這一步約需30min至1h，視樣品的性質而定。
2. 加堿蒸餾：硫酸銨與NaOH(濃)作用生成(NH4)OH, 加熱后生成NH3, 通過蒸餾導入過量酸中和生成NH4Cl而被吸收。
3. 滴定：用過量標準HCl吸收NH3，剩余的酸可用標準NaOH滴定，由所用HCl摩爾數減去滴定耗去的NaOH摩爾數，即為被吸收的NH3摩爾數。此法為回滴法，采用甲基紅衛指示劑。HCl＋NaOHNaCl +H2O
本法適用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量測定。
1.熱源 2. 燒瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒狀玻塞 7. 反應室 8. 反應室外殼 9. 夾子 10. 反應室中插管 11. 冷凝管 12. 錐形瓶 13. 石棉網
圖3.4 微量凱氏蒸餾裝置示意圖
試劑和器材
一、試劑
濃硫酸；30％；10 M氫氧化鈉；0.01M的標準鹽酸；標準硫酸銨(0.3mg氮/mL)。
催化劑：硫酸銅：硫酸鉀＝1：4混合，研細。
指示劑：0.1％甲基紅乙醇溶液。
二、測試樣品
牛血清白蛋白。
三、器材
微量凱氏定氮儀；移液管1mL(×3)；2mL(×1)；微量滴定管5mL(×1); 燒杯200mL(×2)；量筒10mL(×1)；三角燒瓶150mL(×4)；凱氏燒瓶50mL(×4)，吸耳球(×1)；電爐；分析天平。
操作方法
一、樣品處理
稱取牛血清白蛋白50mg，加入2個凱氏燒瓶中，另2個凱氏燒瓶為空白對照，不加樣品。分別在每個凱氏燒瓶中加入約500mg硫酸鉀－硫酸銅混合物，再加5 mL濃硫酸。
二、消化
將以上4個凱氏燒瓶置于通風櫥中電爐上加熱。在消化開始時應控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，繼續消化,使瓶內液體微微沸騰，大約維持2 ~ 3h。待消化液變成褐色后，為了加速完成消化，可將燒瓶取下，稍冷，將30％1 ~ 2滴加到燒瓶底部消化液中，再繼續消化，直到消化液由淡黃色變成透明淡藍綠色，消化即告完成。冷卻后將瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸餾水洗滌燒瓶數次，將洗液并入容量瓶中，定容備用。
三、蒸餾
1. 蒸餾器的洗滌
蒸氣發生器中盛有加有數滴H2SO4的蒸餾水和數粒沸石。加熱后，產生的蒸汽經貯液管、反應室至冷凝管，冷凝液體流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗滌10分鐘左右(此時可用一小燒杯承接冷凝水)。將一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液體中，繼續蒸餾1 ~ 2分鐘，如硼酸液顏色不變，表明儀器已洗凈。
2. 消化樣品及空白的蒸餾
取50mL 錐形瓶數個，各加25mL 0.01M標準HCl和1 ~ 2滴指示劑，用表面皿覆蓋備用。
取2mL 稀釋消化液，由小漏斗加入反應室。將一個裝有0.01M標準HCl和指示劑的錐形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸沒在液體內。
用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液，倒入小漏斗，讓NaOH溶液緩慢流入反應室。尚未盡時，加緊夾子，向小漏斗加入約5mL蒸餾水，同樣緩緩放入反應室，并留少量水在漏斗內作水封。加熱水蒸氣發生器，沸騰后，關閉收集器活塞。使蒸汽沖入蒸餾瓶內，反應生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸餾，移動錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm，并用少量蒸餾水冷凝管口。取下錐形瓶，以0.01M NaOH標準溶液滴定。記下所耗去的體積。
3. 蒸餾后蒸餾器的洗滌
蒸餾完畢后，移取熱源，夾緊蒸汽發生器和收集器間的橡皮管，此時由于收集器溫度突然下降，即可將反應室殘液吸至收集器。
在蒸餾樣品及空白前，為了練習蒸餾和滴定操作，可用標準硫酸銨試做實驗2 ~ 3次。
標準硫酸銨的含氮量是0.3mg/mL，每次實驗取2.0mL。
四、計算
樣品的含氮量(mg/mL)=
若測定的蛋白質含氮部分只是蛋白質(如血清)，則：
樣品中蛋白質含量(mg/mL)＝
式中：A為滴定空白用去的NaOH平均mL數，B為滴定樣品用去的NaOH平均mL數，V為樣品的mL數，0.01 NaOH的摩爾濃度，14為氮的原子量，6.25為系數(蛋白質的平均含氮量為16％，由凱氏定氮法測出含氮量，再乘以系數6.25即為蛋白質量)，N為樣品的稀釋倍數。
注意事項
(1)必須仔細檢查凱氏定氮儀的各個連接處，保證不漏氣。
(2)凱氏定氮儀必須事先反復清洗，保證潔凈。
(3)小心加樣，切勿使樣品沾污口部、頸部。
(4)消化時，須斜放凱氏燒瓶(45o左右)。火力先小后大，避免黑色消化物濺到瓶口、瓶頸壁上。
(5)蒸餾時，小心加入消化液。加樣時將火力擰小或撤去。蒸餾時，切記火力不穩，否則將發生倒吸現象。
(6)蒸餾后應及時清洗定氮儀。
【詳細說明】
蛋白質的定量測定(一)-- 凱氏定氮法
目的要求
(1)學習微量凱氏定氮法的原理。
(2)掌握微量凱氏定氮法的操作方法。
實驗原理
生物材料的含氮量測定在生物化學研究中具有一定的意義，如蛋白質的含氮量約為16％，測出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測定，通常采用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由于具有測定準確度高，可測定各種不同形態樣品等兩大優點，因而被為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質含量的標準分析方法。其原理如下：
1. 消化：有機物與濃硫酸供熱，使有機氮全部轉化為無機氮——硫酸銨。為加快反應，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點。這一步約需30min至1h，視樣品的性質而定。
2. 加堿蒸餾：硫酸銨與NaOH(濃)作用生成(NH4)OH, 加熱后生成NH3, 通過蒸餾導入過量酸中和生成NH4Cl而被吸收。
3. 滴定：用過量標準HCl吸收NH3，剩余的酸可用標準NaOH滴定，由所用HCl摩爾數減去滴定耗去的NaOH摩爾數，即為被吸收的NH3摩爾數。此法為回滴法，采用甲基紅衛指示劑。HCl＋NaOHNaCl +H2O
本法適用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量測定。
1.熱源 2. 燒瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒狀玻塞 7. 反應室 8. 反應室外殼 9. 夾子 10. 反應室中插管 11. 冷凝管 12. 錐形瓶 13. 石棉網
圖3.4 微量凱氏蒸餾裝置示意圖
試劑和器材
一、試劑
濃硫酸；30％；10 M氫氧化鈉；0.01M的標準鹽酸；標準硫酸銨(0.3mg氮/mL)。
催化劑：硫酸銅：硫酸鉀＝1：4混合，研細。
指示劑：0.1％甲基紅乙醇溶液。
二、測試樣品
牛血清白蛋白。
三、器材
微量凱氏定氮儀；移液管1mL(×3)；2mL(×1)；微量滴定管5mL(×1); 燒杯200mL(×2)；量筒10mL(×1)；三角燒瓶150mL(×4)；凱氏燒瓶50mL(×4)，吸耳球(×1)；電爐；分析天平。
操作方法
一、樣品處理
稱取牛血清白蛋白50mg，加入2個凱氏燒瓶中，另2個凱氏燒瓶為空白對照，不加樣品。分別在每個凱氏燒瓶中加入約500mg硫酸鉀－硫酸銅混合物，再加5 mL濃硫酸。
二、消化
將以上4個凱氏燒瓶置于通風櫥中電爐上加熱。在消化開始時應控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，繼續消化,使瓶內液體微微沸騰，大約維持2 ~ 3h。待消化液變成褐色后，為了加速完成消化，可將燒瓶取下，稍冷，將30％1 ~ 2滴加到燒瓶底部消化液中，再繼續消化，直到消化液由淡黃色變成透明淡藍綠色，消化即告完成。冷卻后將瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸餾水洗滌燒瓶數次，將洗液并入容量瓶中，定容備用。
三、蒸餾
1. 蒸餾器的洗滌
蒸氣發生器中盛有加有數滴H2SO4的蒸餾水和數粒沸石。加熱后，產生的蒸汽經貯液管、反應室至冷凝管，冷凝液體流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗滌10分鐘左右(此時可用一小燒杯承接冷凝水)。將一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液體中，繼續蒸餾1 ~ 2分鐘，如硼酸液顏色不變，表明儀器已洗凈。
2. 消化樣品及空白的蒸餾
取50mL 錐形瓶數個，各加25mL 0.01M標準HCl和1 ~ 2滴指示劑，用表面皿覆蓋備用。
取2mL 稀釋消化液，由小漏斗加入反應室。將一個裝有0.01M標準HCl和指示劑的錐形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸沒在液體內。
用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液，倒入小漏斗，讓NaOH溶液緩慢流入反應室。尚未盡時，加緊夾子，向小漏斗加入約5mL蒸餾水，同樣緩緩放入反應室，并留少量水在漏斗內作水封。加熱水蒸氣發生器，沸騰后，關閉收集器活塞。使蒸汽沖入蒸餾瓶內，反應生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸餾，移動錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm，并用少量蒸餾水冷凝管口。取下錐形瓶，以0.01M NaOH標準溶液滴定。記下所耗去的體積。
3. 蒸餾后蒸餾器的洗滌
蒸餾完畢后，移取熱源，夾緊蒸汽發生器和收集器間的橡皮管，此時由于收集器溫度突然下降，即可將反應室殘液吸至收集器。
在蒸餾樣品及空白前，為了練習蒸餾和滴定操作，可用標準硫酸銨試做實驗2 ~ 3次。
標準硫酸銨的含氮量是0.3mg/mL，每次實驗取2.0mL。
四、計算
樣品的含氮量(mg/mL)=
若測定的蛋白質含氮部分只是蛋白質(如血清)，則：
樣品中蛋白質含量(mg/mL)＝
式中：A為滴定空白用去的NaOH平均mL數，B為滴定樣品用去的NaOH平均mL數，V為樣品的mL數，0.01 NaOH的摩爾濃度，14為氮的原子量，6.25為系數(蛋白質的平均含氮量為16％，由凱氏定氮法測出含氮量，再乘以系數6.25即為蛋白質量)，N為樣品的稀釋倍數。
注意事項
(1)必須仔細檢查凱氏定氮儀的各個連接處，保證不漏氣。
(2)凱氏定氮儀必須事先反復清洗，保證潔凈。
(3)小心加樣，切勿使樣品沾污口部、頸部。
(4)消化時，須斜放凱氏燒瓶(45o左右)。火力先小后大，避免黑色消化物濺到瓶口、瓶頸壁上。
(5)蒸餾時，小心加入消化液。加樣時將火力擰小或撤去。蒸餾時，切記火力不穩，否則將發生倒吸現象。
(6)蒸餾后應及時清洗定氮儀。
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