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YIJI動(dòng)物線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI動(dòng)物線粒體呼吸鏈復(fù)合物I（NADH－輔酶Q還原酶）活性定量檢測試劑是一種旨在使用合成輔酶Q同功類似物和抑制復(fù)合物，通過反應(yīng)系統(tǒng)測定樣品中特異性氧化還原酶（oxidoreductase）的活性，即采用比色法測定其氧化后雙峰差值（NADH濃度）的變化，以此進(jìn)行測算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種組織或細(xì)胞的純化線粒體樣品（動(dòng)物或人體）還原型*腺嘌呤二核苷酸（NADH）－輔酶Q還原酶的特異性活性檢測。被用于衰老、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

線粒體呼吸鏈復(fù)合物I，通常稱為還原型*腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase）,是線粒體電子傳遞鏈中zui大的結(jié)構(gòu)成分，含有30至40多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)，其zui特征性的酶活性是魚藤酮敏感的還原型*腺嘌呤二核苷酸－輔酶Q還原酶（NADH:Q Reductase）。復(fù)合物I催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到內(nèi)膜上輔酶Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，為整個(gè)呼吸鏈反應(yīng)系統(tǒng)的*步。NADH－輔酶Q還原酶反應(yīng)系統(tǒng)測定NADH的濃度變化（340nm和380nm的時(shí)間差值），其反應(yīng)方式為：

氧化還原酶

NADH +H＋ + CoQ       ≒      NAD－ + CoQH2

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI緩沖液（Reagent A）                          毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent B）                        毫升

YIJI陰性液（Reagent C）                        毫升

YIJI專性液（Reagent D）                        微升

產(chǎn)品說明書           1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，YIJI緩沖液（Reagent A）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸；YIJI反應(yīng)用戶自備

比色杯：用于比色的容器

雙波長分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI反應(yīng)液（Reagent B）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

一、測定準(zhǔn)備

1．   準(zhǔn)備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里（建議檢測前溶解線粒體）

2．   設(shè)定好雙波長分光光度儀（溫度為30℃）：波長分別為  nm和  nm，時(shí)延  秒，間隔  分鐘，讀數(shù)  次（共  分鐘），并置零

二、背景對照測定

3．   移取  微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色杯

4．   加入  微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B）

5．   加入  微升YIJI陰性液（Reagent C）

6．   上下傾倒數(shù)次，混勻

7．   即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：

（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘－（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘

三、樣品活性測定

8．   移取  微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色杯

9．   加入  微升待測樣品

10．加入  微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B）

11．上下傾倒數(shù)次，混勻

12．即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)：

（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘－（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘

13．（選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8至12，測讀新的樣品

四、樣品失活測定

14．移取  微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色杯

15．加入  微升待測樣品

16．加入  微升YIJI專性液（Reagent D）

17．加入  微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B）

18．上下傾倒數(shù)次，混勻

19．即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品失活讀數(shù)：

（ 波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘－（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘

五、計(jì)算樣品活性

1）樣品總活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[  （樣品容量，毫升）X   （毫摩爾吸光系數(shù)）]＝毫摩爾/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝毫摩爾/毫克或者[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[  （樣品重量，毫克）X  （毫摩爾吸光系數(shù)）]＝毫摩爾/毫克

2）樣品特異活性

樣品活性測定－樣品失活測定＝樣品特異活性

注意事項(xiàng)

1．   本產(chǎn)品為22次操作，包括1次背景對照測定和1次樣品失活測定

2．   所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行

3．   操作時(shí)，須戴手套

4．   YIJI緩沖液（Reagent A）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸

5．   系統(tǒng)操作過程中，背景測定和失活測定只需1次

6．   線粒體樣品檢測前，須溶解；建議凍存融解循環(huán)3次或使用YIJI線粒體溶解試劑盒－YJ10018

7．   加樣后即刻比色測定

8．   反應(yīng)1分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定持續(xù)5分鐘

9．   測定讀數(shù)為5分鐘和0分鐘的差值的值

10．比色測定后，比色杯須清洗*

11．建議待測樣本的OD340為0.2至0.8為理想狀態(tài)

12．如果用戶沒有雙波長同步測定分光光度儀，可以使用單波長340nm替代，注意活性計(jì)算時(shí)，毫摩爾吸光系數(shù)改為6.2

13．樣品特異活性是指魚藤酮敏感的還原型*腺嘌呤二核苷酸－輔酶Q還原酶，排除其它干擾因素（例如復(fù)合物II/III/IV等）

14．本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1．   本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能*穩(wěn)定

2．   本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確可靠