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細胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書
點擊次數:650 發布時間:2015-7-11
YIJI細胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書(中文版)
主要用途
YIJI細胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到CAMKII磷酸化后,進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統,測定產生ADP過程中,伴隨的還原型*腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反應,即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化,以分析細胞裂解樣品中CAMKII活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品(動物、人體)、部分或*純化酶樣品中CAMKII激酶的定量檢測,以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定,高度敏感。
技術背景
Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases;CAMK;EC2.7.11.17)屬于*/*激酶(serine/threonine protein kinase)家屬成員之一,主要由Ca2+/鈣調素復合物調控,在細胞分裂和分化、神經傳導介質分泌、轉錄因子調節、糖原代謝、肌肉收縮、記憶、心功能等方面發揮作用。在大多數組織中表達,尤其在神經組織中高度表達。功能分類為特異型,其代表為肌凝蛋白輕鏈蛋白激酶(myosin light chain kinase;MLCK)和多功能型,其代表為Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II;CAMKII)。亞型分類為I型、II型、和IV型。亞體分類為α、β、γ、δ四種。Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶有3個結構域:N端催化域(catalytic)、*調節域(regulatory,包含自發抑制域——autoinhibitory domain;AID和Ca2+/鈣調素結合中心),和C端協同域(association),Ca2+/鈣調素復合物激活CAMK后,產生自發性自我磷酸化。Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II主要作用于中樞神經系統,調節細胞內鈣離子瞬時變化,誘導長時程增強(potentiation)、突觸可塑性(synaptic plasticity)、神經傳導介質合成和釋放、與記憶和學習功能相關。其磷酸化目標序列為KKALRRQETVDAL。基于底物KKALRRQETVDAL,在ATP的存在下,受到Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II的磷酸化,獲得產物磷酸化多肽,進而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase;LDH)反應系統中,還原型*腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉化為氧化型*腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的變化(340nm),來定量分析Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II的活性。其反應方式為:
產品內容
YIJI清理液(Reagent A) 毫升
YIJI裂解液(Reagent B) 毫升
YIJI緩沖液(Reagent C) 毫升
YIJI酶促液(Reagent D) 微升
YIJI反應液(Reagent E) 微升
YIJI底物液(Reagent F) 微升
YIJI陰性液(Reagent G) 微升
產品說明書 1份
保存方式
保存YIJI清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,嚴格避免光照和反復凍融;有效保證6月
用戶自備
CAMKII激酶:用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品處理的容器
細胞刮脫棒:用于貼壁細胞脫離
(微型)臺式離心機:用于樣品預處理
100微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于光度分析操作的容器
分光光度儀或酶標儀:用于樣品光度分析
實驗步驟
- 待測樣品準備
- 準備好75cm2細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞(1至5 X 107細胞)
- 小心加入xx毫升YIJI清理液(Reagent A),覆蓋生長表面
- 小心抽去清理液
- 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:避免使用*消化)
- 加入xx毫升YIJI清理液(Reagent A),混勻細胞
- 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始)
- 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升YIJI裂解液(Reagent B),充分混勻
- 轉移到預冷的1.5毫升離心管
- 強力渦旋震蕩15秒
- 置于冰槽里孵育30分鐘
- 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
- 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1)
- 即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
- 測定準備
- 準備好待測樣品(例如細胞裂解懸液等),置于冰槽里
- 設定好分光光度儀(溫度為30℃):波長為340nm,間隔1分鐘,讀數6次(共5分鐘),并置零
- YIJI緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度
- 背景對照測定
- 移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI陰性液(Reagent G)
- 放進30℃培養箱里靜置10分鐘
- 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
- 加入xx微升YIJI反應液(Reagent E)
- 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
- 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)
- 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照:340波長讀數0分鐘 -340波長讀數5分鐘
- 樣品測定
- 移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入5微升待測樣品(注意:50微克細胞裂解蛋白;樣品須溶解)
- 放進30℃培養箱里靜置10分鐘
- 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
- 加入xx微升YIJI反應液(Reagent E)
- 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
- 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)
- 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品總活性讀數:340波長讀數0分鐘 -340波長讀數5分鐘
- 計算樣品活性
- 酶標儀測定
- 在96孔板上做好相應標記:背景對照和樣品
- 分別移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C)到96孔板里
- 分別加入xx微升YIJI陰性液(Reagent G)或待測樣品(50微克細胞裂解懸液蛋白)到相應孔里(注意:樣品須清澈)
- 在30℃溫度下孵育10分鐘
- 分別加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
- 分別加入xx微升YIJI反應液(Reagent E)
- 分別加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
- 輕輕搖動96孔板
- 即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數和5分鐘讀數
- 活性計算:
七、抑制劑篩選
- 在96孔板上做好相應標記:背景、*活性和待測抑制劑樣品
- 按下表加入試劑,進行樣品預處理
內容物 | 空背景對照 | 樣本背景 | *酶活性 | 待測抑制劑酶活性 |
YIJI緩沖液(Reagent C) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
YIJI陰性液(Reagent G) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
待測抑制劑 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
用戶自備的純化酶 | —— | —— | xx微升(1毫單位) | xx微升(1毫單位) |
96孔板每孔總量 | 空背景對照孔 (xx微升) | 樣本背景孔 (xx微升) | *活性孔 (xx微升) | 待測抑制劑樣品孔 (xx微升) |
輕輕搖動96孔板,混勻,放進30℃培養箱里孵育15分鐘 |
- 分別加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
- 分別加入xx微升YIJI反應液(Reagent E)
- 分別加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
- 輕輕搖動96孔板
- 即刻放進30℃酶標儀檢測:測讀30分鐘
- 抑制活性計算:
注意事項
- 本產品為25次操作,包括背景操作
- 操作時,須戴手套
- 系統操作過程中,背景測定只需1次
- 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
- 樣品須澄清,至關重要
- 啟動反應后3秒內即刻光度測定
- 測定值由高到低變化;測定可持續30分鐘
- 光度測定后,比色皿須清洗*
- 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性
- 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升(本公司提供 YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-YIJI30030.1)
- 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度
- 可以使用CAMKII抑制劑(KN-93;IC50=370納摩爾)作為抑制劑對照或陰性對照
- Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II活性單位濃度定義:在30℃溫度下,pH 7.5條件下,每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型*腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品
質量標準
- 本產品經鑒定性能穩定
- 本產品經鑒定檢測敏感