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YIJI細(xì)胞/組織過氧化物體（peroxisome）粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細(xì)胞/組織過氧化物體（peroxisome）粗提分離試劑是一種旨在從動物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的過氧化物體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于動物軟組織（肝或腦組織）和培養(yǎng)細(xì)胞的過氧化物體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于脂質(zhì)β-氧化、氨基酸代謝、糖脂和膽汁酸生物合成、蛋白組學(xué)和病理生理學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品*。

技術(shù)背景

過氧化物體（peroxisome）細(xì)胞器在大多數(shù)真核和原核細(xì)胞中普遍存在，為異質(zhì)性（heterogenous）球狀顆粒（spherical particle），0.2至1微米直徑，含有70多種蛋白，主要為酶蛋白。在哺乳動物的肝和腎臟中zui為豐富。一旦過氧化物體異常，將導(dǎo)致澤爾韋格（Zellweger）綜合征。從任何組織或細(xì)胞分離過氧化物體的技術(shù)方法基本上采用：*，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細(xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得過氧化物體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的過氧化物體。 

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI凈化液（Reagent C）   毫升

YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）   毫升

YIJI保存液（Reagent E）   毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存YIJI凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月 

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細(xì)胞

*乙二安四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃臺式離心機(jī)：用于樣品操作

4℃超速離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

實驗步驟

• 動物軟組織過氧化物體分離（組織勻漿法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時） 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

二、動物軟組織過氧化物體分離（化學(xué)處理法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時） 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預(yù)冷的YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

三、動物細(xì)胞過氧化物體分離（細(xì)胞勻漿法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的*乙二安四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3500g

• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

四、動物細(xì)胞過氧化物體分離（化學(xué)處理法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的*乙二安四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預(yù)冷的YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次（1克動物組織或5 X 107細(xì)胞）或50次（200毫克動物組織或1 X 107細(xì)胞）操作
• 實際操作的動物組織重量或細(xì)胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如200毫克動物組織：試劑用量是標(biāo)準(zhǔn)用量的五分之一
• 所有操作均須嚴(yán)格在4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行
• 操作時，須戴手套
• 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴(yán)格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 可見離心后出現(xiàn)的液面頂端的白色脂肪漂浮層，使用吸管或qiang頭小心吸掉
• 對于難以裂解的細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 通常1克動物組織或5 X 107細(xì)胞的過氧化物體含量為1毫克以上過氧化物體蛋白

13． 如果需要獲得99％以上純度的過氧化物體，使用YIJI細(xì)胞/組織高質(zhì)純化過氧化物體分離試劑盒－YIJI10119.3 

• 過氧化物體正常活性測定方法是： CTALASE、HYDROXYPYRUVATE REDUCTASE等
• 本公司提供系列過氧化物體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的過氧化物體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的過氧化物體維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

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