三級生物安全柜是為4級實驗室生物安全等級而設計的，是目前高安全防護等級的安全柜。柜體*氣密，100％全排放式，所有氣體不參與循環，工作人員通過連接在柜體的手套進行操作，俗稱手套箱(Golve box)，試驗品通過雙門的傳遞箱進出安全柜以確保不受污染，適用于高風險的生物試驗。

　　在允許循環化學氣體的操作條件下，可以使用外接排放管道蓋（Exhaust Collar）的A2型。排放管道蓋與一般硬管不同的是有可吸入空氣的進氣孔；排放管道蓋與外排管道連接，然后接到一個外排風機。排放管道蓋上的進氣孔對于A2型通過內置風機保持進氣流和下沉氣流的平衡至關重要。如果使用密封的外接風管，進氣流將會過強可能導致安全柜對產品的保護實效；而排放管道蓋上的進氣孔可以從室內吸入空氣，而不會影響安全柜內的氣流平衡。此條件只適用于微量有毒化學物質。

　　如果不允許循環化學氣體，則必須使用裝備硬管的B2型。由于B型安全柜不是獨立平衡系統，它的內置風機只能制造下沉氣流，安全柜依賴外排風機制造進氣流。這種型號的安全柜在安裝和維護時會較為復雜，因為外排風機必須與內置風機保持平衡，否則將導致對操作人員或產品的安全性能的失效。