p0017s快速銀染試劑盒

碧云天快速銀染試劑盒SDS-PAGE蛋白染色p0017s(Fast Silver Stain Kit)是一種快速簡單、可用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白銀染的試劑盒。本試劑盒也可以用于2D凝膠的銀染，并且染色后和后續的質譜檢測兼容。

圖1. 本試劑盒PAGE膠銀染效果圖。BSA(左圖)和Hela細胞裂解液(右圖)在SDS-PAGE后使用本試劑盒進行銀染的效果圖。左側泳道均為蛋白分子量標準。左圖為獲得較高的檢測靈敏度，顯色時間較長，已經產生了橙黃色的背景；右圖顯色時間較短，僅出現淺土黃色的背景。

本試劑盒可足夠用于25塊常規的8×10cm凝膠的銀染。
包裝清單：

保存條件：

室溫保存，一年有效。銀溶液(100X)和銀染顯色加速液(2000X)需避光保存。
注意事項：
  由于銀染靈敏，操作時請注意盡量使用高純度的水，并確保所使用的器皿非常清潔，使用潔凈的玻璃器皿。操作時必須戴手套，避免皮膚和凝膠直接接觸。
  下述使用說明中各種溶液的使用量適用于大小為8×10cm厚度為0.75-1mm的凝膠。對于更大的凝膠，各種溶液的使用量需按凝膠面積的比例放大，對于更厚的凝膠，作用時間需按照厚度的比例適當延長。
  本說明書所指的室溫為20-25℃，操作溫度較低時由于溶液的擴散能力下降，各步驟需適當延長時間。
銀染基本顯色液(5X)在低溫環境下可能會出現少量沉淀，可在30-50℃水浴中溶解，并充分混勻后使用。至少后續稀釋至1X后須確保溶解。

使用說明：
1. 固定：
電泳結束后，取凝膠放入約100ml固定液中，在搖床上室溫搖動20分鐘，搖動速度為60-70rpm。固定 40分鐘以上甚至過夜可以進一步降低背景。
固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml Milli-Q級純水或雙蒸水，混勻后即成100ml固 定液。
2. 30%乙醇洗滌：
棄固定液，加入100ml 30%乙醇，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。
30%乙醇的配制：70ml Milli-Q級純水或雙蒸水中加入30ml乙醇，混勻后即成100ml 30%乙醇。
3. 水洗滌：
棄30%乙醇，加入200ml Milli-Q級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。如果本步驟用水洗滌更長時間，對降低染色的背景略有幫助。
4. 增敏：
棄水，加入100ml銀染增敏液(1X)，在搖床上室溫搖動2分鐘，搖動速度為60-70rpm。
銀染增敏液(1X)的配制：99ml Milli-Q級純水或雙蒸水中加入1ml銀染增敏液(100X)，混勻后即為銀 染增敏液(1X)。銀染增敏液(1X)配制后需在2小時內使用。
5. 水洗滌(共2次)：
棄原有溶液，加入200ml Milli-Q級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1分鐘，搖動速度為60-70rpm。
棄水，再加入200ml Milli-Q級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1分鐘，搖動速度為60-70rpm。
6. 銀染：
棄水，加入100ml銀溶液(1X)，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。
銀溶液(1X)的配制：99ml Milli-Q級純水或雙蒸水中加入1ml銀溶液(100X)，混勻后即為銀溶液 (1X)。銀溶液(1X)配制后需在2小時內使用。
7. 水洗滌：
棄原有溶液，加入100ml Milli-Q級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1-1.5分鐘，搖動速度為 60-70rpm。
注意：水洗滌的時間不能超過1.5分鐘。
8. 顯色：
棄水，加入100ml銀染顯色液，在搖床上室溫搖動3-10分鐘，直至出現比較理想的預期蛋白條帶，搖 動速度為60-70rpm。
銀染顯色液的配制：80ml Milli-Q級純水或雙蒸水中加入20ml銀染基本顯色液(5X),再加入0.05ml銀 染顯色加速液(2000X)，混勻后即為銀染顯色液。銀染顯色液配制后需在20分鐘內使用。
9. 終止：
棄銀染顯色液，加入100ml銀染終止液(1X)，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。終止 時有氣體產生屬正常現象，產生的氣體為二氧化碳。
銀染終止液(1X)的配制：95ml Milli-Q級純水或雙蒸水中加入5ml銀染終止液(20X),混勻后即為銀染 終止液(1X)。銀染終止液(1X)配制后宜當天使用。
10. 水洗滌：
棄銀染終止液，加入100ml Milli-Q級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動2-5分鐘，搖動速度為 60-70rpm。
11. 保存：
可在Milli-Q級純水或雙蒸水中保存。或采用適當的方式制備成干膠。

常見問題：
1. 背景太深：
a. 顯色時間過長。通常顯色反應會在10分鐘內結束，顯色反應時間過長會導致背景很深。
b. 洗滌不充分。洗滌時間過短，或洗滌液加入的量不足，或者容器過于狹小導致搖動時溶液不易充分混合，或搖動速度過慢，導致混勻不充分。請按照說明書的建議確保各種溶液的用量和作用時 間，搖床的推薦速度為60-70rpm。
c. 凝膠中原有的緩沖液等未在固定步驟中去除干凈。一方面需確保固定的時間和固定液的用量，另 一方面對于不是常用的Bis-Tris緩沖的凝膠需要更長的固定時間以充分去除凝膠中的原有緩沖成分，以降低背景。
d. 水的純度太低。需使用大于16 MΩ. cm的高*純度水。
2. 蛋白條帶淺：
a. 蛋白的半(Cysteine)殘基的含量低或幾乎沒有。半殘基的存在對于銀染很重要，半殘基的含量過低會導致檢測靈敏度下降。
b. 銀染后水洗滌時間過長。在銀溶液染色時需嚴格控制水洗滌的時間，水洗滌的時間不能超過1.5分 鐘，否則會導致過多的銀離子被洗去，導致檢測靈敏度下降。
c. 上樣量不足。本試劑盒檢測BSA的靈敏度可以達到0.3ng，對于不同的蛋白檢測靈敏度可能不同。 對于一些蛋白可能需要大于1ng的蛋白量才能被檢測到。
d. 固定步驟后的洗滌不夠充分。確保洗滌和水洗滌的用 量和時間，可以適當延長洗滌時間。
3. 凝膠上出現小點或或其它非蛋白的痕跡：
a. 凝膠沒有充分被溶液浸沒。請注意選擇大小合適的容器，并加入足量的各種溶液，同時需保持適 當的混勻速度確保凝膠可以被溶液浸沒。
b. 用于銀染的容器沒有充分洗滌干凈。容器需先用洗滌劑充分洗滌，隨后用自來水充分沖洗，再用高純度水再洗滌數次。該容器能用于銀染，并注意避免各種可能的蛋白污染。為確保充 分洗滌干凈，對于耐化學腐蝕的容器，例如玻璃容器。
c. 指紋或其它壓痕。請注意戴手套操作，切勿直接接觸皮膚。操作時請注意盡量勿擠壓、折疊或摩 擦凝膠。
d. 有金屬物質接觸凝膠。金屬物質例如金屬鑷子等接觸凝膠會出現非特異性痕跡。
4. 在60-70 kD處出現一片模糊的蛋白染色背景：
皮膚上脫落的角蛋白(keratin)污染了蛋白樣品。一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋 白樣品的容器蓋子盡量不要敞開，甚至在取放蛋白樣品時在超凈臺內進行以避免可能的角蛋白污染。
5. 在凝膠的頂端處出現黃色背景：
a. 樣品中DTT濃度高。采用其它適當的還原試劑，或者在許可范圍內適當減少DTT的用量。
b. 采用Tris-Glycine-SDS電泳體系。Tris-Glycine-SDS電泳體系中的Glycine會導致背景凝膠的頂端 出現輕微的黃色背景。換用Tris-Tricine-SDS電泳體系則可顯著消除此黃色背景。
6. 銀在染色器皿中出現沉淀：
染色器皿中可能含有殘余的洗滌劑或上次銀染時的殘余試劑。需確保把染色器皿洗滌干凈。

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