染色樣本分析

操作步驟

1.準備蛋白質儲備溶液（溶液A）：

將100μL反應緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標蛋白溶液（如抗體，蛋白質濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL，再加入1 mL蛋白質標記原液。

注1：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH低于8.0，則使用1M碳S氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節至8.0-9.0的范圍。

注2：蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注3：不純的抗體、穩定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會被很好的標記。疊D化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應?？梢酝ㄟ^透析或旋轉柱除去疊D化鈉或硫柳汞，以獲得標記結果。

注4：如果蛋白質濃度低于2 mg / mL，則結合效率會顯著降低。為獲得標記效率，建議蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準備染料儲備溶液（溶液B）：

將無水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始綴合前準備染料儲備溶液（溶液B），及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環。

3.確定染料/蛋白質比例（可選）：

注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能影響其結合親和力，而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定染料/蛋白質比率。通常，對于大多數染料 - 蛋白質綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）作為起始點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質溶液（95μl溶液A）有效搖動。假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD，蛋白質的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10％。

3.2運行綴合反應（參見下面的步驟4）。

3.3重復＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。

3.4使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。

3.5計算上述4種結合物的染料/蛋白質比（DOS）。

3.6檢測上述4種結合物，確定的染料/蛋白質比例，以擴大標記反應。

4.運行結合反應：

4.1有效加入適量的染料儲備溶液（溶液B）到蛋白質溶液（溶液A）的小瓶中晃動。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過步驟3，我們建議使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比。

4.2繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質綴合物的實例。

5.1按照說明書準備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。

注1：立即使用時，染料 - 蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

圖示

圖1.將HeLa細胞與（Tubulin +）或（Tubulin-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后與iFluor 488山羊抗小鼠IgG綴合物（綠色，左）和AlexaFluor®488山羊抗小鼠IgG綴合物（綠色）一起孵育，右）。細胞核用Hoechst 33342（藍色）染色。

圖2.人淋巴細胞上AlexaFluor®488和iFluor 488抗人CD4的流式細胞儀分析。在每個測試中，PBMC細胞都用0.5 ug 488抗人CD4和0.5 ug iFluor 488抗人CD4染色。在ACEA流式細胞儀系統上進行流式細胞儀分析。

圖3. HeLa細胞先用兔抗微管蛋白染色，再用iFluor 488山羊抗兔IgG（H + L）染色，細胞核用nuclear red DCS1染色。