Amplite NADP檢測(cè)試劑盒 藍(lán)色熒光是美國(guó)AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NADP的試劑盒，*酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和*酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是活細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的許多酶反應(yīng)的兩個(gè)重要輔助因子。 NAD形成NADP，通過(guò)酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。通過(guò)光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。量化這些因子的產(chǎn)生或消耗是監(jiān)測(cè)酶介導(dǎo)的反應(yīng)或篩選這些酶反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑或底物的重要方法。市場(chǎng)上有幾種用于量化NADPH或總NADP / NADPH量的試劑盒，但迄今為止在大量過(guò)量NADPH存在下檢測(cè)NADP是非常具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)镹ADP在260 nm處具有其吸收峰且不發(fā)熒光，使測(cè)量不實(shí)用。

Amplite NADP檢測(cè)試劑盒可快速檢測(cè)NADP。該試劑盒使用我們新開(kāi)發(fā)的NADP傳感器Quest Fluor NADP試劑直接測(cè)量NADP。該試劑盒中使用的專有探針僅與NADP反應(yīng)產(chǎn)生在Ex / Em = 420 / 480nm處熒光的產(chǎn)物，并且對(duì)NADPH幾乎沒(méi)有響應(yīng)。該試劑盒可在100μL測(cè)定體積中檢測(cè)少至30 nM NADP，并在過(guò)量NADPH存在下監(jiān)測(cè)0.3％NADP產(chǎn)生。該測(cè)定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行，并且可以用于高通量篩選。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NADP檢測(cè)試劑盒 藍(lán)色熒光。

96孔板檢測(cè)示例

概述

準(zhǔn)備NADP標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）

添加20μLQuestFluor™NADP探針

添加20μL測(cè)定溶液

在室溫下孵育10-20分鐘

添加15μL增強(qiáng)劑溶液

在室溫下孵育10-20分鐘，監(jiān)測(cè)420/480 nm的熒光

注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分。

操作步驟

1.準(zhǔn)備NADP儲(chǔ)備溶液：

將500μlddH2O加入到NADP標(biāo)準(zhǔn)品（組分D）的小瓶中以制備1mM NADP儲(chǔ)備溶液。

注意：未使用的NADP儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20 ℃。

2.準(zhǔn)備NADP標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋液（0至10μM）：

2.1將10μL的NADP儲(chǔ)備液（來(lái)自步驟1）加入到990L H2O或PBS緩沖液中以產(chǎn)生10M NADP標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NADP標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

2.2取200μL10μMNADP標(biāo)準(zhǔn)溶液，在H2O或PBS中進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到NADP標(biāo)準(zhǔn)品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM系列稀釋液。

2.3如表1所述，將50μL系列稀釋的NADP標(biāo)準(zhǔn)品和含有NADP的測(cè)試樣品加入黑色/固體底96孔微孔板中：

表1黑色/固體底部96孔微孔板中NADP標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局

注意1：NS = NADP標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。

注意2：將連續(xù)稀釋的NADP標(biāo)準(zhǔn)品（10μM至0.01μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。

3.運(yùn)行NADP測(cè)定：

3.1將20μLQuestFluor NADP探針（組分A）溶液加入NADP標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照品和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中，充分混合。

3.2將20μL測(cè)定溶液（組分B）加入每個(gè)孔中，充分混合。

注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和10μLQuestFluor™NADP探針和10μL分析溶液。

3.3在室溫下孵育反應(yīng)10-20分鐘，避光。

3.4向每個(gè)孔中加入15μL增強(qiáng)劑（組分C），使總NADP測(cè)定體積為105μL/孔，并在室溫下孵育10-20分鐘，避光。

注意：對(duì)于384孔板，添加7.5 uL增強(qiáng)劑。

3.5使用熒光板讀數(shù)器在420/480 nm處檢測(cè)熒光增加。