mFluor Violet 450 馬來酰亞胺  染料是美國AAT Bioquest生產的熒光標記染料，AAT Bioquest的mFluor 染料專為多色流式細胞儀應用而開發。這些染料具有大的斯托克斯位移，并且可以通過流式細胞儀的激光線（例如，405nm，488nm和633nm）很好地激發。mFluor Violet 450染料的熒光激發和發射大值分別為~405 nm和~450 nm。這些光譜特性使其成為Pacific Blue 標記染料的替代品。mFluor Violet 450馬來酰亞胺是穩定的，并且與巰基顯示出良好的反應性和選擇性。mFluor Violet 450馬來酰亞胺提供了一種方便的工具，可用于標記單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質（> 10 kDa），用于紫外激光激發的流式細胞儀應用。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優質的mFluor Violet 450 馬來酰亞胺  染料。

操作方法

注意：該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與mFluor 450 SE的綴合物開發的。 您需根據您的實際情況而定。

1.準備蛋白質儲備溶液（溶液A）：

將100μL反應緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標蛋白溶液（如抗體，蛋白質濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL給1 mL蛋白質標記原液。

注1：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸an鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節至8.0-9.0的范圍。

注2：蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質溶解在Tris或甘D酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩定的不純抗體或抗體不能很好標記。疊D化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應?？梢酝ㄟ^透析或旋轉柱除去疊D化鈉或硫柳汞，以獲得標記結果。

注4：如果蛋白質濃度低于2 mg / mL，則結合效率顯著降低。為獲得標記效率，建議蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準備染料儲備溶液（溶液B）：

將無水DMSO加入到mFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始綴合之前準備染料儲備溶液（溶液B）及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可以在不受光照和潮濕的情況下儲存在冰箱中兩周。 避免凍融循環。

3.確定染料/蛋白質比例（可選）：

注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能對其結合親和力產生不利影響，而低染料/蛋白質比率的蛋白質結合物會降低靈敏度。 我們建議您通過使用連續不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定染料/蛋白質比率。通常，對于大多數染料 - 蛋白質綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）作為起始點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質溶液（95μl溶液A）有效搖動。假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD，蛋白質的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10％。

3.2進行綴合反應（參見下面的步驟4）。

3.3重復＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1; 分別為15：1和20：1。

3.4使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。

3.5計算上述4種結合物的染料/蛋白質比（DOS）。

3.6運行上述4種結合物的功能測試，以確定的染料/蛋白質比例，以擴大您的標記反應。

4.運行結合反應：

4.1在有效搖動下，將適量的染料儲備溶液（溶液B）加入到蛋白質溶液（溶液A）的小瓶中。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。 如果跳過步驟3，我們建議使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）。

4.2繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質綴合物的實例。

5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在樹脂頂部表面下方運行后立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質綴合物的級分。

注1：立即使用時，染料 - 蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質結合物溶液需要濃縮或冷凍干燥