Amplite 熒光法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒是一種464kD的四聚體。β-半乳糖苷酶的每個單元由五個結構域組成，其中第三個是活性位點。它是細胞中的一種必需酶。這種酶的缺乏會導致半乳糖苷中毒或莫奎奧B綜合征。在大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶是通過激活LacZ操縱子而產生的。LacZ表達的檢測已成為常規，檢測到的-每細胞半乳糖苷酶。該試劑盒使用熒光半乳糖苷酶底物，可以敏感地區分LacZ+和LacZ細胞。它可以用于檢測ELISA型檢測系統中的半乳糖苷酶綴合物或用于監測細胞中LacZ基因的表達。半乳糖苷酶裂解產物的發射光譜可以用大多數配備FITC濾波片的熒光儀器檢測。百螢生物為您提供優質的Amplite 熒光法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒。

樣品實驗方案

簡要概述

1.用LacZ基因制備穩定或瞬時轉染的細胞
2.用測試化合物孵育細胞（樣品）
3.裂解細胞
4.將裂解液轉移至微量滴定板
5.添加FDG工作解決方案
6.根據細胞類型，在室溫或37°C孵育至少5分鐘
7.添加停止解決方案
8.監測Ex / Em = 490/525 nm的熒光強度

溶液制備 

1.儲備溶液

所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。 避免重復凍融循環。
1.1 FDG儲備溶液（1倍）：
將125 µL DMSO（組分E）加入FDG（組分A）小瓶中，制成1X FDG儲備液。 注意：25 µL FDG足以裝滿1個板，避光。

2.標準溶液

β-半乳糖苷酶標準品
可選（如果需要標準曲線）：用0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液制備一系列β-半乳糖苷酶（大腸桿菌）標準品的稀釋液。 將標準曲線上每個點的等分試樣50 µL轉移至平板的對照孔中。 β-半乳糖苷酶的高推薦量為200 mU / mL（200-400 ng）。 建議對標準曲線進行2倍系列稀釋，包括8個點。 注意：調整標準曲線以適合特定的實驗條件，例如細胞類型，數量，轉染效率和培養板的大小。 每次進行測定時，必須新鮮制備標準曲線的稀釋液。

3.工作溶液

3.1 0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液：
將30 µLβ-巰基乙醇（組分F）添加到10 mL反應緩沖液（組分B）中，并充分混合。
注意：制備酶稀釋緩沖液需要額外的緩沖液，用于生成標準曲線。

3.2 FDG工作方案：
將25 µL 1X FDG儲備溶液加到5 mL的0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液中。 注意：請勿將FDG溶液在室溫下長時間放置，否則會發生自發水解。

3.3 裂解緩沖液工作液：
使用前，將5 µLβ-巰基乙醇（組分F）加入5 mL裂解緩沖液（組分D）中。 注意：在裂解細胞之前，將0.1％β-巰基乙醇添加到裂解緩沖液中

樣品操作及分析

表1.細胞培養板推薦的Lysis Buffer工作溶液體積

1.從哺乳動物細胞制備細胞提取物

1.1用測試化合物處理含有LacZ基因的細胞所需的時間。

1.2用1X PBS洗滌細胞兩次。不要移動細胞。

1.3用Lysis Buffer工作溶液相應地裂解細胞。

1.3.1對于貼壁細胞：將Lysis Buffer工作溶液添加至培養板。有關建議的數量，請參見表1。

1.3.2對于非貼壁細胞：將細胞沉淀到離心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取決于細胞沉淀的大小）。

1.4將上一步的細胞在室溫下孵育10-15分鐘，然后輕輕旋轉平板或試管數次以確保裂解。

1.5繼續進行FDG測定或將樣品在-80°C下冷凍直至使用。注意：通過快速的凍融循環（在-20°C到-80°C冷凍1-2小時，然后在室溫解凍）也可以獲得良好的裂解。或者，將細胞裂解液離心2-3分鐘以沉淀不溶物，然后測定上清液。

2.運行?-半乳糖苷酶測定

2.1如果需要，在室溫下解凍裂解細胞管或板。如果細胞接種在96孔板上，則直接在96孔板上進行測定。

2.2在96孔板的每個孔中加入50 µL細胞提取物。如果需要標準曲線，請為標準曲線保存一些對照孔（50 uL /孔）。注意：如有必要，當轉染效率很高時，可在裂解緩沖液工作溶液中稀釋裂解液，或在轉染效率低時減少裂解液的體積。如果在96孔板上進行轉染，或將穩定的細胞系接種到96孔板上，請直接在板上進行測定。對于內源性β-半乳糖苷酶活性控制，請添加50 µL非轉染細胞的細胞裂解液。對于空白對照，添加50 µL 1X裂解緩沖液。

2.3向每個孔中加入50 µL FDG工作溶液。根據細胞類型，將板在室溫或37°C下孵育大約5分鐘至4小時。

2.4向每個孔中添加50 µL終止緩沖液（組分C）。終止緩沖液除了終止反應之外，還引起產物的熒光強度增加。

2.5用熒光酶標儀在Ex / Em = 490/525 nm處測量每個孔中溶液的熒光強度。

2.6根據線性標準曲線定量?-半乳糖苷酶表達。