樣品實驗方案 

溶液制備 

1.儲備溶液

所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1 DAX-J2 PON Green 99儲備溶液（500X）：
在DAX-J2 PON Green 99（組分A）的小瓶中加入20 µL DMSO（組分C），制成500X儲備溶液。注意：20 µL的復(fù)配DAX-J2 PON Green 99儲備溶液足以容納1個板,遠(yuǎn)離光線。

1.2 過氧亞硝酸鹽（ONOO）儲備溶液（未提供）：
根據(jù)文獻(xiàn)報道合成了過氧亞硝酸鹽儲備溶液。簡而言之，用鹽酸（0.6M）酸化亞硝S鈉（0.6M）和過氧化氫（0.7M）的混合物，并在1-2秒內(nèi)加入氫氧化鈉（1.5M）以使溶液呈堿性。使溶液通過短的二氧化錳柱除去過量的過氧化氫。過亞硝酸鹽溶液在0.1 M NaOH中的消光系數(shù)在302 nm下為1670 M-1cm-1。 ONOO的儲備溶液不穩(wěn)定。我們強烈建議使其新鮮使用。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液

過氧亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)
在測定緩沖液（組分B）中稀釋過氧亞硝酸鹽（ONOO）儲備液，以得到20 µM ONOO 標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，以得到連續(xù)稀釋的ONOO 標(biāo)準(zhǔn)溶液（O7-O1）。

3.工作溶液

將20μL的500X DAX-J2 PON Green 99儲備溶液添加到10 mL的測定緩沖液（組分B）中并充分混合。 注意：此分析混合物足以用于一個96孔板，避光。

樣品操作及實驗分析

表1.黑色96孔微孔板中ONOO標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。 O = ONOO標(biāo)準(zhǔn)（O1-O7，0.313至20 µM）； BL =空白對照； TS =測試樣品

表2.每個孔的試劑組成

1.根據(jù)表1和表2提供的布局，準(zhǔn)備ONOO標(biāo)準(zhǔn)品（O），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50 µL。

2.將50 µL工作溶液添加到ONOO標(biāo)準(zhǔn)，空白對照和測試樣品的每個孔中，以使ONOO測定總體積為100 µL /孔。 對于384孔板，請向每個孔中添加25 µL工作溶液，總體積為50 µL /孔。

3.在避光條件下，于室溫下孵育反應(yīng)5至10分鐘。

4.使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測Ex / Em = 490/530 nm（在515 nm處截止）的熒光增加。