適用儀器

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞密度為0.5-1×10 6細(xì)胞/ mL

2. 用測(cè)試化合物處理細(xì)胞以誘導(dǎo)超氧化物

3. 將1 µL 500X MitoROS 580加到0.5 mL細(xì)胞懸液中

4. 將細(xì)胞在37°C染色1小時(shí)

5. 使用帶有FL2通道的流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度

溶液配制

儲(chǔ)備溶液配制

1. MitoROS 580儲(chǔ)備溶液（500X）：將100 µL DMSO（組分C）添加到MitoROS 580（組分A）小瓶中，并充分混合以制成500X MitoROS 580儲(chǔ)備溶液。避光。注意：請(qǐng)密閉存放。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 對(duì)于每個(gè)樣品，在自備的0.5 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基或緩沖液中制備細(xì)胞，密度為5×10 5至1×10 6個(gè)細(xì)胞/ mL。注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每種細(xì)胞系，以確定超氧化物誘導(dǎo)的細(xì)胞密度。
   
   

2. 在分析緩沖液（組分B）或自備的緩沖液（例如PBS）中用25 µL 20X測(cè)試化合物處理細(xì)胞以誘導(dǎo)超氧化物。對(duì)于對(duì)照細(xì)胞（未處理的細(xì)胞），添加相應(yīng)量的化合物緩沖液。
   
   

3. 將細(xì)胞在37°C孵育至少30分鐘。注意：將 Jurkat細(xì)胞在37°C下用50 µM抗霉suA（AMA）處理30分鐘以誘導(dǎo)超氧化物。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參見圖1。
   
   

4. 將0.5 µL細(xì)胞懸浮液中加入1 µL 500X MitoROS 580儲(chǔ)備液。
   
   

5. 在37°C下孵育1小時(shí)。注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在MitoROS 580孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌一次。適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于單個(gè)細(xì)胞的類型和測(cè)試使用的化合物。

6. 使用帶有FL2通道的流式細(xì)胞儀（Ex / Em = 488/590 nm）檢測(cè)熒光強(qiáng)度。